Visualisation de vivo des vésicules synaptiques Dans Drosophila larves axones segmentaire
Summary
Ce protocole traite de la dissection en direct de<em> Drosophile</emLarves> dans le but de l'imagerie du mouvement de la GFP taggés vésicules axonales sur les pistes des microtubules.
Abstract
Élucider les mécanismes du transport axonal a montré pour être très important pour déterminer comment les défauts de transport de longue distance affectent différentes maladies neurologiques. Défauts dans ce processus essentiel peut avoir des effets néfastes sur le fonctionnement neuronal et le développement. Nous avons développé un protocole de dissection qui est conçu pour exposer les<em> Drosophile</em> Larvaires nerfs segmentaires pour voir le transport axonal en temps réel. Nous avons adapté ce protocole pour l'imagerie en direct de celui publié par Hurd et Saxton (1996) utilisé pour immunolocalizatin des larves de nerfs segmentaires. Une dissection minutieuse et conditions de tampon adéquate sont essentiels pour maximiser la durée de vie de la larve disséquée. Lorsqu'il est correctement fait, les larves ont montré disséqué transport vésiculaire robuste pour 2-3 heures dans des conditions physiologiques. Nous utilisons la méthode UAS-GAL4<sup> 1</sup> Pour exprimer la GFP taggés APP ou vésicules synaptotagmine au sein d'un seul axone ou axones de nombreuses larves de nerfs segmentaires en utilisant différents neurones GAL4 conducteurs. D'autres marqueurs fluorescent marqués, par exemple mitochondries (Mitotracker) ou les lysosomes (Lysotracker), peut aussi être appliqué aux larves avant la visualisation. GFP-vésicule mouvement et le mouvement des particules peuvent être affichées simultanément à l'aide des longueurs d'onde distinctes.
Protocol
Discussion
L'imagerie de vivo du transport des vésicules synaptiques dans les nerfs des larves de drosophile segmentaire est un outil puissant pour étudier les mécanismes de transport axonal. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour évaluer la dynamique de transport dans les nerfs des larves exprimer élargi répète polyQ à élucider comment l'expansion de répétitions affecter la dynamique des trois transport vésiculaire. En utilisant ce protocole la vitesse de déplacemen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SG est soutenu par des fonds de l'Université d'État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei.
MK a été soutenu par une bourse de recherche par curca UB.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Scientific | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | ||
| 2 Pair Forceps | Fischer Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | ||
| Box of Dissection Pins | Fine Scientific | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Génétique. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
