Мы предлагаем метод выделения и культивирования чистых популяций клапанов сердца эндотелиальных клеток (VEC). VEC может быть изолирован от обеих сторон пороге или листовку и сразу после, лежащие в основе интерстициальная клетка (ВМЦ) изоляции прост.
Сердце клапаны полную ответственность за сохранение однонаправленный поток крови через сердечно-сосудистой системы. Эти тонкие, волокнистые ткани подвергаются значительным механическим нагрузкам, как они открываются и закрываются в несколько миллиардов раз срок службы. Невероятная выносливость этих тканей происходит из-за резидентом клапанной эндотелия (VEC) и интерстициальные клетки (ВМЦ), которые постоянно ремонта и реконструируют в ответ на местные механические и биологические сигналы. Только недавно мы начали понимать уникальное поведение этих клеток, для которых в лабораторных экспериментов сыграло ключевую роль. Особенно сложным является изоляция и культуры VEC. Особое внимание должно быть использовано с момента ткань удаляется от хоста через окончательного покрытия. Здесь мы представляем протоколы для прямого изоляции, боковые конкретных изоляции, культуры, и проверка чистых популяций VEC. Мы используем ферментативного пищеварения следуют нежный технику соскабливания тампон, чтобы выбить только клетки поверхности. Эти клетки затем собирают в трубку и центрифугировали в гранулах. Осадок затем ресуспендировали и высевают в культуру колбы предварительно покрытых с коллагеном I матрицы. VEC фенотип подтверждается контакт ингибирует рост и экспрессию эндотелиальных специфических маркеров, таких как PECAM1 (CD31), фактор фон Виллебранда (фВ), и негативные выражения альфа-актин гладких мышц (α-SMA). Функциональные характеристики VEC связаны с высоким уровнем ЛПНП ацетилированного. В отличие от сосудистых эндотелиальных клеток, VEC имеют уникальную способность трансформироваться в мезенхимы, которое обычно происходит во время эмбрионального формирование клапана 1. Это также может произойти во время значительно увеличивал сливной должность в пробирке культуру, поэтому следует позаботиться должны быть направлены на прохождение в или около слияния. После выделения VEC, чистых популяций VIC могут быть легко приобретены.
Понимание клапанной биологии была нарушена технические трудности выделения и культивирования чистых популяций клапанной эндотелиальных клеток. Типичные методы изоляции включают ферментативного переваривания основных базальных матрицы или химической диссоциации эндотелиальных о…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование проводится при поддержке NSF КАРЬЕРА награду, Хартвелл Фонда и Американской ассоциации сердца (# 0830384N).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |