Isolering av valvulär endotelceller
Summary
Vi erbjuder en metod för att isolera och odling rena populationer av endotelceller hjärtklaff celler (VEC). VEC kan isoleras från vardera sidan av randen eller broschyren och omedelbart efter, är underliggande interstitiella celler (VIC) isolering okomplicerat.
Abstract
Hjärtklaffar är ensamt ansvariga för enkelriktad blodflödet genom det kardiovaskulära systemet. Dessa tunna, fibrösa vävnaden utsätts för stora mekaniska påfrestningar som de öppna och stänga flera miljarder gånger under en livstid. Den otroliga uthållighet av dessa vävnader beror på den inhemska valvulär endothelial (VEC) och interstitiella celler (VIC) som ständigt reparerar och renoverar som svar på lokala mekaniska och biologiska signaler. Först nyligen har vi börjat förstå de unika beteenden hos dessa celler, som in vitro experiment har spelat en nyckelroll. Särskilt utmanande är den isolering och odling av VEC. Särskild försiktighet måste användas från det att vävnad tas bort från värddatorn genom sista plätering. Här presenterar vi protokoll för direkt isolering, sida specifika isolering, kultur, och verifiering av rena populationer av VEC. Vi använder enzymatisk spjälkning följt av en mjuk kompress skrapning teknik för att få bort bara ytan celler. Dessa celler är sedan samlas i ett rör och centrifugeras i en pellet. Pelleten är då återsuspenderade och klädd i kultur kolvar före belagda med kollagen I matris. VEC fenotyp bekräftas av kontakt hämmad tillväxt och ett uttryck av endotelceller specifika markörer som PECAM1 (CD31), von Willebrands faktor (vWF), och negativa uttryck av alfa-glatt muskulatur aktin (α-SMA). Den funktionella egenskaper VEC är förknippade med höga nivåer av acetylerade LDL. Till skillnad från vaskulära endotelceller, VEC har den unika förmågan att förvandla sig till mesenkym, vilket normalt inträffar under fosterutvecklingen ventil bildandet 1. Detta kan också ske under betydligt längre inlägg konfluenta in vitro-kultur, så försiktighet bör göras för passage vid eller nära sammanflödet. Efter VEC isolering kan rena populationer av VIC sedan lätt förvärvas.
Protocol
Discussion
En förståelse av valvulär biologi har minskat till följd av tekniska svårigheter att isolera och odling rena populationer av valvulär endotelceller. Typiska isolering tekniker innebär enzymatisk nedbrytning av den underliggande basala matris eller kemisk dissociation av endotelceller självhäftande obligationer 2,3. Preliminära isolering experiment var bedömda kvalitativt genom att variera dissociation agenter och perioder inkubation. Resultaten av dessa experiment visade att EDTA (eller Trypsin-EDT…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av NSF KARRIÄR priset, Hartwell Foundation och American Heart Association (# 0830384N).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Mediatech | 50-103-PB | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140 | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | ||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | H4784-1G | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| DPBS | Gibco | 21300-058 | ||
| Rat Tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | ||
| Critical Swabs | VWR | 89031-270 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 55761 | ||
| T25 Flasks | BD Biosciences | 353018 | ||
| T75 Flasks | BD Biosciences | 353136 | ||
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | ||
| 60×15 mm Dishes | VWR | 25384-092 | ||
| 60×15 Glass Dishes | VWR | 89000-310 | ||
| Paraffin Embedding Wax | Electron Microscopy Sciences | 19304-01 | ||
| Precision Glide Needles | BD Biosciences | 305165 | ||
| 500 mL Nalgene Filters | VWR | 73520-985 | ||
| 1L Nalgene Filters | VWR | 73520-986 | ||
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 11023-15 | ||
| FSC Tweezers #5 | Fine Science Tools | 11295-00 |
References
- Thompson, R. P., Fitzharris, T. P. Morphogenesis of the truncus arteriosus of the chick embryo heart: the formation and migration of mesenchymal tissue. Am J Anat. 154, 545-556 (1979).
- Johnson, C. M., Fass, D. N. Porcine cardiac valvular endothelial cells in culture: A relative deficiency of fibronectin synthesis in vitro. Lab Invest. 49 (5), 589-598 (1983).
- Manduteanu, I., Popov, D., Radu, A., Simionescu, M. Calf cardiac valvular endothelial cells in culture: production of glycosaminoglycans, prostacyclin and fibronectin. J Mol Cell Cardiol. 20 (2), 103-118 (1988).
- Cheunyg, W. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. JHVD. 17 (6), 674-681 (2008).
- Paranya, G., Vineberg, S., Dvorin, E., Kaushal, S., Roth, S. J., Rabkin, E., Schoen, F. J., Bischoff, J. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. Am J Pathol. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Butcher, J. T., Penrod, A., Garcia, A. J. M., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arterioscler Thromb Vasc Bio. 24 (1), 1429-1434 (2004).
- Simmons, C. A., Grant, G. R., Manduchi, E., Davies, P. F. Spatial heterogeneity of endothelial phenotypes correlates with side-specific vulnerability to calcification in normal porcine aortic valves. Circ Res. 96, 792-799 (2005).
- Butcher, J. T., Tressel, S., Johnson, T., Turner, D., Sorescu, G., Jo, H., Nerem, R. M. Transcriptional Profiles of Valvular and Vascular Endothelial Cells Reveal Phenotypic Differences: Influence of Shear Stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 69-69 (2006).
- Parachuri, S., Yang, J. H., Aikawa, E., Melero-Martin, J. M., Khan, Z. A., Loukogeorgakis, S., Schoen, F. J., Bischoff, J. Human Pulmonary Valve Progenitor Cells Exhibit Endothelial/Mesenchymal Plasticity in Response to Vascular Endothelial Growth Factor-A and Transforming Growth Factor-β2. Circ Res. 99 (8), 861-869 (2006).
- Shi, Q. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92, 362-367 (1998).
- Rehman, J., Li, J., Orschell, C. M., March, K. L. Peripheral blood endothelial progenitor cells are derived from monocyte/macrophages and secrete angiogenic growth factors. Circulation. 107, 1164-1169 (2003).
