Moustiques Anopheles stephensi sont des vecteurs de la malaria qui habitent en Inde et en Asie. Cette vidéo montre la technique pour effectuer des micro-injections de cette espèce avec des transgènes qui confèrent une résistance à la malaria au moustique. Une grande partie de la méthodologie démontrée dans cette vidéo est applicable à des techniques de micro-injection d'autres espèces de moustiques.
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Article de méthode
Injection d'un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'introduction de gènes exogènes dans les génomes des moustiques nécessite des techniques de micro-injection adaptés aux espèces d'intérêt particulier. Ce protocole vidéo montre une méthode utilisée par le laboratoire de James microinject constructions d'ADN dans des embryons stephensi Anopheles pour la génération de moustiques transformé. Les techniques de préparation des aiguilles de microinjection, la collecte et la préparation des embryons et l'exécution des micro-injection sont illustrés.
Protocole
Préparation à l'avance de la micro-injection:
- Moustiques nourrissent de sang: pour l'injection du lundi au mercredi femelles se nourrissent le vendredi précédent. Pour injecter jeudi et vendredi, les femelles se nourrissent le lundi de la même semaine.
- Préparer les aiguilles à quartz utilisant le programme 2 et tampon isotonique (voir matériaux).
- "Pose du tube" pour les embryons est le flacon de culture régulière drosophile. Coton humide dans le fond, avec un disque de papier filtre humide qui la recouvre.
- Préparer lamelle en plastique en collant double-face de la cassette à une extr....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Aiguilles en quartz pour injection | Sutter Instrument Co. | Préparées à partir de capillaires de 1,0 mm de diamètre extérieur, 0,70 mm de diamètre intérieur et 10 cm de longueur, étirés en une pointe fine de 3 à 8 µm à l’aide d’un tireur de micropipettes, avec une tige d’environ 100 à 300 mm. | ||
| Tireur de quartz | Outil | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Paramètres : Chaleur-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| Kit de plasmide EndoFree | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Colonne Millex-GV | SLGV RO4 NL | Pour la purification de l’ADN | ||
| ADN du vecteur | 0,5 mg/mL | |||
| Plasmide auxiliaire | 0,3 mg/mL | |||
| Solution d’injection | Tampon | Solution 1x : 5 mM KCl, 0,1 mM phosphate de sodium, pH 6,8 | ||
| Tampon isotonique | Voir la recette dans la section du protocole | |||
| Huile de dessiccation | Huile Halocarbon 700 : huile Halocarbon 27 (1:1). Bien mélanger. Préparer à l’avance avant l’injection microscopique. | |||
| Sang | Pour nourrir les moustiques | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Moustiques, mâles et femelles. | ||
| Flacon de culture de Drosophile | Pour la ponte des œufs | |||
| Boîtes de Pétri | Avec tampon isotonique, pour l’éclosion des embryons | |||
| Pinceau fin | Sable # 0000 | |||
| Papier Whatman 3MM | ||||
| Pinces #5 | ||||
| Adhésif double face | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica Microsystems | Avec plateau mobile et micromanipulateur, réglé à un grossissement de 10x |
Réimpressions et autorisations
