Adenovirus की मध्यस्थता संवर्धित प्राथमिक माउस भ्रूणीय Fibroblasts में संकेतन अणुओं के आनुवंशिक हटाना

Summary

इस वीडियो में हम एक adenovirus Cre recombinase प्राथमिक माउस भ्रूणीय floxed Rac1 एलील ले fibroblasts संक्रमित जीन ले जाने का उपयोग करें.

Abstract

आनुवंशिक रूप से विभिन्न सेल संकेतन cascades की विशिष्ट घटकों को दूर करने की क्षमता आधुनिक संकेत transduction विश्लेषण में अभिन्न उपकरण किया गया है. इस सशर्त विलोपन को प्राप्त करने के एक विशेष विधि Cre – loxP प्रणाली के उपयोग के माध्यम से है. इस विधि loxP साइटों, जो Cre recombinase प्रोटीन के लिए विशिष्ट मान्यता दृश्यों के साथ ब्याज की जीन flanking शामिल है. Cre की मध्यस्थता loxP साइटों पर पुनर्संयोजन घटना है, और बीच ³ जीन के बाद छांटना में इस एंजाइम परिणामों के तथाकथित floxed डीएनए (loxP साइट द्वारा flanked) के एक्सपोजर. कई अलग अलग तरीकों के लिए ब्याज की साइट Cre recombinase प्रशासन मौजूद हैं. इस वीडियो में, हम एक Cre recombinase संक्रमित प्राथमिक माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts floxed Rac1 ¹ एलील युक्त भ्रूण से प्राप्त जीन युक्त adenovirus का उपयोग प्रदर्शित करता है. हमारे प्रयोगों के लिए Rac1 MEFs का चयन करने के लिए हमारी तर्क यह है कि स्पष्ट morphological परिवर्तन Rac1 का विलोपन, ^actin cytoskeleton 2,5 में परिवर्तन के कारण पर देखा जा सकता है है. वायरल पारगमन और Cre अभिव्यक्ति के बाद 72 घंटे, कोशिकाओं का उपयोग actin डाई phalloidin दाग थे और लेजर confocal स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged. यह देखा गया है कि MEFs जो एडिनो – Cre वायरस को उजागर किया गया था अनुबंधित और दर्शन आकारिकी में लम्बी असंक्रमित कोशिकाओं की तुलना में, ^{पिछले} 2,5 रिपोर्ट के साथ संगत . Cre recombinase प्रसव के adenovirus विधि फायदेमंद है के रूप में एडिनो – Cre वायरस आसानी से उपलब्ध है, और जीन विलोपन Cre के माध्यम से कोशिकाओं के लगभग 100% में अनुकूलित adenoviral संक्रमण के साथ प्राप्त किया जा सकता है.

Protocol

विगलन कोशिकाओं तरल नाइट्रोजन से जमी माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts (व्यक्तिगत भ्रूण प्राथमिक संस्कृतियों से पहले उत्पन्न) प्राप्त करते हैं. 37 में शीशी में डुबो कर पिघलना कोशिकाओं ° घूमता जब तक सामग्री पूरी तरह thawed कर रहे हैं के साथ सी पानी. DMEM के 9mL है कि 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और एक 10cm सेल संस्कृति प्लेट% 1 पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक जोड़ें. Thawed सेल निलंबन की थाली करने के लिए ड्रॉप – वार जोड़ें, थाली धीरे रॉक °% 5 सी, सीओ 2 रातोंरात इनक्यूबेटर 37 में कोशिकाओं और जगह की थाली फैलाने. नोट करें कि अगर कोशिकाओं DMSO (जमने की प्रक्रिया से) के प्रति संवेदनशील हैं, प्रारंभिक मीडिया ताजा मीडिया के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है के बाद कोशिकाओं थाली (लगभग चार घंटे पोस्ट चढ़ाना) का पालन किया है. विगलन के बाद भी कि कोशिकाओं के संगम नोट जमे हुए कोशिकाओं की संख्या पर निर्भर करता है, कोशिकाओं की ठंड के बाद वसूली दर, और कोशिकाओं की वृद्धि दर. Passaging कोशिकाओं जब कोशिकाओं को अनिवार्य रूप से 100 confluency% (यानी: अगले दिन) के लिए बड़े हो गए हो, मीडिया aspirate और बाँझ पीबीएस के 5ml के साथ कोशिकाओं को धो. पीबीएस निकालें और trypsin के 1ml लगभग 5 मिनट के लिए 10mm EDTA और इनक्यूबेटर में जगह प्लेट युक्त जोड़ने के लिए कोशिकाओं की थाली से अलग करने की अनुमति है. जब कोशिकाओं को अलग किया है, trypsinized कोशिकाओं को मीडिया के 9mL जोड़, पिपेट 2-3 बार करने के लिए फैलाने के clumps, इस निलंबन की 1ml एक नए मीडिया के 9mL युक्त थाली पर ड्रॉप – वार जोड़ने, और रातोंरात ° सी इनक्यूबेटर 37 में इस जगह . मीडिया में FBS की उपस्थिति trypsin वैकल्पिक रूप से निष्क्रिय करने के लिए, कोशिकाओं पहली बार धोया जा सकता है बाहर trypsin पतला. कवर फिसल जाता है पर कोशिकाओं गिनती और चढ़ाना इनक्यूबेटर से कोशिकाओं निकालें धो लें, और इस समय 5-6mL मीडिया 9mL के बजाय trypsinized कोशिकाओं को वापस जोड़ने के अलावा, पहले के रूप में trypsinize. पिपेट कोशिकाओं को अच्छी तरह से एक एकल कक्ष निलंबन में पूरा पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए, और एक अलग microfuge ट्यूब में trypan नीले रंग की 15μL साथ गठबंधन 15μL हटा. ऊपर और नीचे pipetting कई बार इस सेल / trypan नीले निलंबन मिक्स, और hemocytometer जोड़ने के लिए 15μL. खुर्दबीन के तहत, मृत कोशिकाओं नीले दिखाई देगा. एक 4X4 ग्रिड में hemocytometer पर / स्पष्ट बेरंग (जी) कोशिकाओं की संख्या की गणना. तीन अन्य 4X4 ग्रिड (चिह्नित ए, बी, सी और डी) पर इस गणना को दोहराएँ और निलंबन की μL प्रति कक्षों की संख्या की गणना के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें: प्रोटोकॉल अनुकूलन के माध्यम से, हम निर्धारित किया है कि उचित सेल घनत्व में प्रयोग के समापन पर दृश्य के लिए 30,000 कोशिकाओं परिणाम चढ़ाना. सेल 30,000 कोशिकाओं के लिए आवश्यक निलंबन की मात्रा की गणना करने के लिए, निम्न समीकरण का उपयोग करें: अब एक छह अच्छी तरह से डिश के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक बाँझ गिलास को कवर पर्ची जगह और एक अच्छी तरह से मीडिया के 2ml जोड़ने, और तब प्रत्येक अच्छी तरह से में अपने सेल निलंबन 30,000 कोशिकाओं के लिए आवश्यक मात्रा से ड्रॉप – वार जोड़ने. नोट कि गिलास को कवर फिसल जाता है इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के रूप में हम एक बाद में समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं का उपयोग visualizing हो जाएगा, नहीं अनुप्रयोगों के सभी जरूरी माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता जाएगा, और इस तरह कवर फिसल जाता है की आवश्यकता नहीं किया जा सकता है. वायरस transduction कई घंटे या रातोंरात (सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं कवर फिसल जाता है का पालन करने के लिए पर्याप्त समय) के बाद मीडिया को हटाने और सीरम मुक्त DMEM के 1ml के साथ कोशिकाओं धोने. प्रत्येक अच्छी तरह से वायरस के अलावा के लिए सीरम मुक्त मीडिया की 1ml जोड़ें. इस प्रयोग के लिए, वायरस एडिनो – Cre व्यावसायिक वेक्टर Biolabs से प्राप्त किया गया था. पिछला प्रोटोकॉल अनुकूलन दिखाया गया है कि संक्रमण के 500 के (MOI) बहुलता प्राथमिक MEFs में सेल व्यवहार्यता पर कम या कोई प्रभाव के साथ अत्यधिक कुशल जीन पारगमन प्रदान करता है. MOI इस प्रकार के रूप में गणना की जा सकती है: वायरस की गणना की मात्रा प्रत्येक अच्छी तरह से है कि संक्रमित हो जाता है सीधे, धीरे थाली रॉक करने के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में वायरस और जगह की कोशिकाओं को फैलाने रातोंरात. अगली सुबह को हटाने, वायरस युक्त कोशिकाओं से मीडिया और 1ml बाँझ पीबीएस में कोशिकाओं को धोने और तब हर अच्छी तरह से नियमित रूप से मीडिया के 2ml जोड़ने. इस प्रयोग में उदाहरण Rac1 कोशिकाओं के मामले में, morphological परिवर्तन लगभग 72 बजे पोस्ट पारगमन कोशिकाओं में हुई. प्रतिनिधि परिणाम कक्ष कल्पना थेघ actin डाई phalloidin (इमेजिंग प्रयोजनों के लिए केवल) के साथ धुंधला हो जाना और Guelph विश्वविद्यालय की उन्नत विश्लेषण केंद्र में Leica टीसीएस SP5 multiphoton लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग imaged. चित्रा 1 Rac1 / flox flox कोशिकाओं है कि एक ही वायरस के लिए उजागर नहीं कोशिकाओं की तुलना में एडिनो – Cre वायरस से अवगत कराया गया के अनुबंधित और लम्बी आकारिकी से पता चलता है. चित्रा 1 Rac1 flox / flox एडिनो – Cre वायरस (बाएं) के साथ एक ही स्रोत (दाएं) से असंक्रमित कोशिकाओं की तुलना में संक्रमित कोशिकाओं के बीच तुलना.

Discussion

साथ वीडियो मिसाल है कि कैसे एक रीकॉम्बीनैंट वायरस उत्पाद इन विट्रो में एक विशेष जीन Cre recombinase का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन इस प्रोटोकॉल के विकास को संबोधित लायक कुछ विशेष अंक प्रकट किया.

• उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं हमेशा जब adenoviruses के साथ काम नियोजित किया जाना चाहिए है. एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने हर समय पहना होना चाहिए, जबकि वायरस के साथ काम. मीडिया और प्लास्टिक के बर्तन कम से कम 30 मिनट के लिए 10% ब्लीच के साथ इलाज किया जाना चाहिए, और उसके बाद प्लास्टिक के बर्तन autoclaved होना चाहिए.
• बचें दोहराया फ्रीज विगलन वायरस शेयर के रूप में इस वायरस टिटर को प्रभावित और इस तरह पारगमन दक्षता को कम कर सकते हैं. वायरस शेयर की लघु मात्रा शुरू में अलग – अलग ट्यूबों में aliquoted जाना चाहिए.
• 5-50 से लेकर MOIs विधि विकास के दौरान परीक्षण किया गया और कुशल पारगमन दर ज्यादातर मामलों में मनाया गया, सेल व्यवहार्यता पर नकारात्मक प्रभाव के बिना.
• एडिनो – GFP भी विधि विकास के दौरान इस्तेमाल किया गया था करने के लिए जल्दी से पारगमन क्षमता स्क्रीन. यह नियंत्रण (या एक खाली वेक्टर) अकेले कि वायरल संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के दौरान आयोजित किया जाना चाहिए सेलुलर परिवर्तन में परिणाम नहीं करता है. इसी तरह, अगर अपने कोशिकाओं में ब्याज की floxed जीन excising किसी भी सेलुलर परिवर्तन (यानी आकारिकी या व्यवहार्यता में परिवर्तन) में परिणाम नहीं करता, तो एडिनो – GFP के साथ एक ही सेल प्रकार का संक्रमण प्रदर्शित करने के लिए वायरस पारगमन का उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है होने वाली.

संस्कृति में cascades संकेत की परीक्षा के अलावा, एडिनो – Cre दृष्टिकोण भी vivo में नियोजित किया गया करने के लिए सशर्त प्रयोगात्मक ^3,4 जानवरों से जीन निकालने के लिए, और ⁶ जीव के भीतर कोशिकाओं के विशिष्ट आबादी लेबल. adenovirus प्रणाली भी Cre recombinase के अलावा अन्य मेजबान कोशिकाओं में जीन का परिचय करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस वितरण सदिश का उपयोग करने के दो प्रमुख लाभ अपने उच्च पारगमन और जीन डिलीवरी दक्षता, और मेजबान डीएनए के साथ एकीकरण की कमी कर रहे हैं. हालांकि, उपन्यास रीकॉम्बीनैंट adenoviruses की पीढ़ी श्रम गहन जा सकता है. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित इसलिए पहले से विकसित एडिनो – Cre वायरस द्वारा शोषण adenoviral प्रणाली की शक्ति harnesses, और युग्मन है कि हमारे हित, Rac1 के floxed एलील के साथ. प्रयोग बाहर इस सशर्त दस्तक के माध्यम से, हम पुष्टि की है कि पारगमन एडिनो – Cre MEFs floxed Rac1 एलील ले जाने के वायरस का उपयोग वास्तव Rac1 के छांटना Rac1 ^की कमी 2,5 कोशिकाओं के सेलुलर आकारिकी विशेषता में परिवर्तन के लिए अग्रणी के कारण है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Ad-CMV-Cre virus		Vector Biolabs	1045
DME High glucose media 500mL		Fisher	SH3002201
FBS Canadian origin 500mL		VWR	CAA15-701
PEN-STREP 1X solution 100mL		Fisher	SV30010
Texas Red-X phalloidin		Invitrogen	T7471
Trypsin		Sigma	T4549