कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) दुर्दमताओं का एक संख्या में पहचान की गई है. इस प्रोटोकॉल में हम एक प्रवाह cytometric एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज गतिविधि और CD44 और CD24 अभिव्यक्ति का उपयोग मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता xenografts से सीएससी अलग विधि का वर्णन. इन व्यवहार्य कोशिकाओं तो कार्यात्मक और विश्लेषणात्मक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) दुर्दमताओं का एक बढ़ती संख्या में पहचान की गई है और कार्यात्मक उनके आत्म नवीकरण से गुजरना और विभेदित एक संतान का उत्पादन करने की क्षमता के द्वारा परिभाषित कर रहे हैं. इन गुणों के सीएससी मूल ट्यूमर पुनरावृत्ति जब immunocompromised चूहों में इंजेक्ट करने की अनुमति देते हैं. सीएससी एक उपकला द्रोह के भीतर पहली बार स्तन कैंसर में वर्णित किया गया और पाया विशिष्ट कोशिका की सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति (CD44 + CD24 कम / -) प्रदर्शित करने के लिए 2. तब से, सीएससी अन्य मानव CD44 और CD24 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य सतह प्रतिजनों के एक नंबर का उपयोग malignancies की एक बढ़ती हुई संख्या में पहचान की गई है. एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज गतिविधि (ALDH) सहित शारीरिक गुण, भी घातक ऊतकों से 3-5 सीएससी अलग इस्तेमाल किया गया है है.
हाल ही में, और हम दूसरों से सीएससी अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ALDH गतिविधि और कोशिका की सतह CD44 और CD24, और 6-8 CD133 प्रतिजनों की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचान. ये अत्यधिक tumorigenic आबादी या हो सकता है अतिव्यापी सकता है और नहीं हो सकता है अन्य कार्यों को प्रदर्शित. हमने पाया है कि ALDH + और CD44 CD24 + + अग्नाशय सीएससी इसी तरह tumorigenic हैं, लेकिन ALDH + कोशिकाओं अपेक्षाकृत अधिक आक्रामक 8. इस प्रोटोकॉल में हम कम बीतने मानव 9 xenografts से व्यवहार्य अग्नाशय सीएससी अलग विधि का वर्णन. Xenografted ट्यूमर चूहों से काटा जाता है और एक एकल कक्ष निलंबन में बनाया. ऊतक मलबे और मृत कोशिकाओं को जीवित कोशिकाओं से अलग हैं और फिर CD44 और CD24 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर और ALDEFLUOR अभिकर्मक, 10 ALDH की एक फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट का उपयोग दाग. सीएससी तो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई के द्वारा अलग कर रहे हैं. आइसोलेटेड सीएससी तो व्यवहार्य कोशिकाओं की आवश्यकता होती है विश्लेषणात्मक या कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल मानव xenografts से अग्नाशय के सीएससी के अलगाव का वर्णन करता है. इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम व्यवहार्य सीएससी की उपज में वृद्धि होगी. अग्नाशय के सीएससी की एक शुद्ध आबादी की वसूली व्यवहार्य FACSAria पर सॉर्ट करने से पहले सेल निलंबन में मौजूद कोशिकाओं की शुद्धता पर निर्भर है. देखभाल xenografts है कि सबसे बड़ा व्यास में 1 सेमी से कम कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए ट्यूमर के केंद्र में परिगलित ऊतक की मात्रा को कम करने में मदद करता है. इसके अतिरिक्त, Ficoll Paque ढाल centrifugation के दौरान ऊतक मलबे और मृत कोशिकाओं के सेल निलंबन घट महत्वपूर्ण है और अगर ऊतक मलबे या गैर – व्यवहार्य कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या जब कोशिकाओं hemocytometer पर गिना जाता है पता चला रहे हैं दोहराया जा सकता है है.
धुंधला प्रोटोकॉल का वर्णन यहाँ ALDEFLUOR अभिकर्मक प्रणाली का इस्तेमाल करने के लिए ALDH के रूप में अच्छी तरह के रूप में गतिविधि fluorophore – संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए विशेष सेल की सतह प्रतिजनों का पता लगाने. ALDEFLUOR धुंधला 37 पर किया जाता है डिग्री सेल्सियस और, इसलिए, पहले एंटीबॉडी धुंधला (बर्फ पर) एंटीबॉडी कैपिंग के लिए संभावित ° जो 37 में हो सकता है सी. रोकने के लिए पूरा होने की जरूरत चूंकि कोशिकाओं ALDEFLUOR अभिकर्मक तपका कर सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है 4 बजे ALDEFLUOR बफर में कोशिकाओं को बनाए रखने ° सी ALDEFLUOR धुंधला के बाद पूरा हो गया है. ALDEFLUOR बफर एक दवा तपका अवरोध करनेवाला है कि ALDEFLUOR के intracellular स्तर को बनाए रखने में मदद करता है शामिल हैं.
चूंकि इस विधि व्यवहार्य अग्नाशय सीएससी आइसोलेट्स वे प्रयोगों है कि इन कोशिकाओं के शारीरिक समारोह को मापने का एक संख्या में लागू किया जा सकता है. हम ट्यूमर दीक्षा immunocompromised चूहों और में इन विट्रो सेल / प्रवास आक्रमण assays उपयोग assays के लिए इन कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है. इसके अलावा, शाही सेना डीएनए और प्रोटीन विश्लेषणात्मक सीएससी और गैर – सीएससी आबादी की तुलना अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं से एकत्र किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से WM अनुदान (CA127574, CA107040 और CA09071) द्वारा समर्थित किया गया
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-118 | ||
Fetal calf serum | Harlan (Indianapolis, IN) | BT-9501 | ||
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Collagenase type IV | Invitrogen | 17104-019 | ||
Dispase | Sigma (St. Louis, MO) | D4818 | ||
100 x 20 mm culture dish | BD Biosciences (San Jose, CA) | 353003 | ||
70-μm filter | BD Biosciences | 352350 | ||
50-mL conical tube | BD Biosciences | 352070 | ||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare (Upsala, Sweden) | 17-1440 | ||
ALDEFLUOR reagent system | Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 01700 | ||
Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes | BD Biosciences | 352054 | ||
CD44-APC (clone G44-26) | BD Biosciences | 559942 | ||
CD24-PE (clone ML5) | BD Biosciences | 555428 | ||
Mouse CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | ||
Mouse lineage-biotin | Miltenyi Biotec (Auburn, CA) | 130-092-613 | ||
Mouse H-2Kd-biotin | BD Biosciences | 553564 | ||
IgG2bκ-APC | BD Biosciences | 555745 | ||
IgG2aκ-PE | BD Biosciences | 555574 | ||
Streptavidin-PerCP protein | BD Biosciences | 554064 | ||
Propidium iodide | Sigma | P4170 | ||
12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps | BD Biosciences | 352235 |