के ईमानदार इमेजिंग ड्रोसोफिला भ्रूण
Summary
हम यहाँ मौजूद दाग के लिए एक बढ़ते प्रोटोकॉल<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण है कि पार वर्गों confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग की इमेजिंग की अनुमति देता है एक ईमानदार स्थिति में है.
Abstract
कई प्रसिद्ध morphogenetic gradients और सेलुलर आंदोलनों के पृष्ठीय / वेंट्रल अक्ष के साथ होते हैं<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण. हालांकि, मौजूदा ऐसी प्रक्रियाओं को देखने के लिए तकनीक का इस्तेमाल कुछ हद तक सीमित हैं. निम्नलिखित प्रोटोकॉल तय बढ़ते है और लेबल के लिए एक नई तकनीक का वर्णन<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण confocal इमेजिंग के साथ राज्याभिषेक देखने के लिए. इस विधि ग्लिसरीन जेली बढ़ते मीडिया की दो परतों के बीच भ्रूण एम्बेड के होते हैं, और इमेजिंग जेली स्ट्रिप्स ईमानदार तैनात है. भ्रूण sandwiching के लिए पहले कदम के लिए एक स्लाइड पर ग्लिसरीन जेली की पतली बिस्तर बनाने के लिए है. अगला, भ्रूण को ध्यान से इस सतह पर जुड़ रहे हैं और जेली का एक दूसरे परत के साथ कवर किया. बाद दूसरी परत जम है, जेली के स्ट्रिप्स काट रहे हैं और ईमानदार इमेजिंग के लिए रूप से फ़्लिप. वैकल्पिक के लिए इस्तेमाल किया जा खुर्दबीन स्टैंड के प्रकार पर निर्भर करता है भ्रूण को दृश्यमान करने के लिए वर्णित कर रहे हैं. चूंकि पृष्ठीय – वेंट्रल अक्ष के साथ सभी कोशिकाओं को एक एकल confocal Z विमान के भीतर imaged हैं, हमारे विधि photobleaching या प्रकाश longitudinally घुड़सवार भ्रूण के 3D पुनर्निर्माण के लिए आम बिखरने के बिना सटीक माप और फ्लोरोसेंट संकेतों की तुलना की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
ड्रोसोफिला भ्रूण के पार अनुभाग छवियों लेना, चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि यह या तो 2 स्लाइस या सूक्ष्म तक्षणी प्रसंस्करण, जो आम तौर पर होता है फ्लोरोसेंट stainings के लिए हानिकारक के लिए एम्बेडेड मीडिया के उपयोग के एक सावधान हाथ विच्छेदन की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, एक confocal खुर्दबीन में बने Z-ढेर पार अनुभाग छवियों के 3D पुनर्निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह समय लगता है एक सटीक 3D पुनर्निर्माण और photobleaching problematical हो जाता है के लिए कई पतली स्लाइस Confocal है. एक और चिंता का विषय है जब इमेजिंग भ्रूण कि longitudinally बढ़ रहे हैं प्रकाश बिखरने है कि तब होता है जब भ्रूण है, जो भी संकेतों के फ्लोरोसेंट प्रोटीन या mRNA अभिव्यक्ति 1 स्तर की मात्रा का ठहराव के उद्देश्य के लिए सटीक माप लेने पेचीदा गहरी वर्गों तक पहुँचने है. यहां तक कि एक दो photon confocal खुर्दबीन के साथ, प्रकाश बिखरने अभी भी एक भ्रूण है, जो तक ही सीमित होना करने के लिए नमूने के इष्टतम पारदर्शिता के लिए बढ़ते मीडिया का चयन करता है के बीच में जर्दी सामग्री की अस्पष्टता के कारण चिंता का विषय है.
इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, एक नया "अंत पर स्थिति भ्रूण की इमेजिंग तकनीक बुलाया खड़ी हाल ही में दोनों रहते हैं और अचल नमूने 4 छवि के लिए विकसित किया गया था. इस पत्र में, हम खड़ी घुड़सवार भ्रूण के लिए एक नए प्रोटोकॉल है कि अनुमति देता है एक सरल और किसी भी आकार और आकार है कि कई के साथ स्वस्थानी 3 जांच में दाग तय भ्रूण या ऊतकों की तैयारी दृश्य विकसित की है. हमारी विधि पतला संगति के साथ एक बढ़ते मीडिया है कि इसके भीतर गठबंधन भ्रूण डिब्बे में बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग करने के होते हैं. इस बढ़ते एम्बेडेड भ्रूण युक्त मीडिया के कट ब्लॉक Confocal खुर्दबीन के किसी भी प्रकार में इमेजिंग पहले तैनात ईमानदार हो सकते हैं.
जेली में भ्रूण एम्बेडिंग और उन्हें स्थिति खड़ी करके, हम क्षैतिज पार वर्गों ले confocal माइक्रोस्कोपी, जिसमें भ्रूण के उदर अक्ष पृष्ठीय साथ कोशिकाओं को एक साथ प्रस्तुत कर रहे हैं का उपयोग कर रहे हैं. यह प्रकाश बिखरने और फ्लोरोसेंट रंजक है कि longitudinally घुड़सवार भ्रूण के पारंपरिक जेड ढेर पुनर्निर्माण में होता photobleaching अब सफाया कर रहे हैं की समस्याओं के बाद से एक मात्रा का ठहराव के प्रयोजनों के लिए महत्वपूर्ण सुधार है. इस प्रकार, जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन का स्तर पृष्ठीय – वेंट्रल अक्ष साथ की मात्रा का ठहराव सटीक है, क्योंकि विपरीत पृष्ठीय वेंट्रल पदों पर स्थित कोशिकाओं को एक ही समय में और एक ही confocal Z स्थिति पर imaged हैं. इसके अलावा, वर्णित विधि हमें एक 3 – डी भ्रूण से अक्ष पृष्ठीय उदर भर जटिल कम्प्यूटेशनल unrolling तरीकों का उपयोग करने के लिए डीवी 6 अक्ष के साथ विभिन्न पदों पर कोशिकाओं कल्पना के बिना एक पूर्ण छवि 2 – डी प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है .
कुछ महत्वपूर्ण कदम भ्रूण aligning के बाद अतिरिक्त ग्लिसरॉल हटाने, जेली की दो परतों के बीच विभाजन से बचने के शामिल हैं. हालांकि, अगर नमूना भी निर्जलित है, जिसके परिणामस्वरूप छवि कुरूप हो सकता है और गलत आकारिकी है. इसके अलावा, अगर भ्रूण के आसपास जेली मध्यम सीधे के बजाय एक कोण पर काटा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप छवि कम दौर और अधिक ovular आकार में, एक 90 डिग्री के अलावा अन्य कोण पर एक भ्रूण के गलत स्थिति के कारण प्रकट हो सकता है. अंत में, अगर जेली पर्याप्त निकट पूर्वकाल / पीछे समाप्त होता है पर भ्रूण में कटौती नहीं है, यह संभव है क्योंकि उद्देश्य की दूरी काम मुख्य रूप से जेली और नहीं भ्रूण में ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के लिए एक उचित छवि प्राप्त नहीं है.
एक अन्य महत्वपूर्ण कदम है कि आवश्यक हो सकता है जब इमेजिंग देर gastrulating भ्रूण ध्यान से गुंजाइश तहत पहले उन्हें aligning के हित के चरणों तरह हो सकता है. आमतौर पर, भ्रूण morphological विशेषताओं है कि सबसे अधिक आसानी से जब एक अनुदैर्ध्य स्थिति में मान्यता प्राप्त कर सकते हैं अनुसार मंचन कर रहे हैं.
वैकल्पिक संशोधनों है कि इस विधि के साथ बनाया जा सकता है है के अलावा जेली फ्लोरोसेंट रंजक के photobleaching के खिलाफ की रक्षा करने में मदद की दूसरी परत में एक विरोधी फीका अभिकर्मक (जैसे पी Phenylenediamine या पीपीडी) शामिल है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक दबोरा हैरिस और डेनिएल मकाय करने के लिए विशेष रूप से ऋणी हैं. इस काम के लिए समर्थन जीवविज्ञान और कला और CWRU के विज्ञान के कॉलेज के विभाग द्वारा प्रदान की गई थी, और HHMI जैविक विज्ञान में स्नातक की शिक्षा के समर्थन के लिए अनुदान संख्या 52005866 से.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences Company | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. | |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Zeiss | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | ||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | ||||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | ||
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). | |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisherfinest | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. | |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | ||
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | |||
| Spatula | Fisher | 21-401-10 | ||
| Hypodermic needles | Fisher | 1482610 | 26 Gauge | |
| Pipettes | Labnet |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
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- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
