माउस आँखों से रेटिना स्टेम सेल के अलगाव
Summary
इस वीडियो में, हम प्रदर्शन करेंगे कैसे माउस आँख के सिलिअरी उपकला से रेटिना स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए और उन्हें संस्कृति में विकसित करने के लिए clonal रेटिना क्षेत्रों फार्म. क्षेत्रों है कि अलग कर रहे हैं, स्टेम कोशिकाओं के कार्डिनल गुणों के अधिकारी: आत्म नवीकरण और multipotentiality.
Abstract
वयस्क माउस रेटिना स्टेम सेल (RSC) एक दुर्लभ मौन स्तनधारी 1,2,3 आँख के सिलिअरी उपकला (CE) के भीतर पाया सेल है . CE, गैर pigmented भीतर और pigmented बाहरी सेल परतों के ऊपर बना है, और clonal RSC कालोनियों कि CE से एक pigmented सेल से उत्पन्न दोनों pigmented और गैर pigmented कोशिकाओं जो विभेदित किया जा सकता है से बना रहे हैं के लिए सभी फार्म तंत्रिका रेटिना और RPE की कोशिका प्रकार. वहाँ कि सभी क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं सब कुछ कम से कम 4 वर्णक होते हैं के बारे में कुछ विवाद है, लेकिन कोशिकाओं को अभी भी अलग सेल प्रकार तंत्रिका 1-3 रेटिना के भीतर पाया बनाने में सक्षम हैं. कुछ प्रजातियां, amphibians और मछली जैसे, उनकी आँखों में 5 की चोट के बाद उत्थान के लिए सक्षम हैं, तथापि, स्तनधारी आंख ऐसी कोई पुनर्योजी गुण से पता चलता है. हम vivo में स्टेम सेल की पहचान और तंत्र है कि स्तनधारी रेटिना स्टेम कोशिकाओं 6-8 मौन रखने को समझने की चोट के बाद भी रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत के रूप में उन्हें का उपयोग करने के लिए आँख की चोट की मरम्मत शारीरिक या आनुवंशिक मॉडल की मदद की तलाश के माध्यम से 9-12 प्रत्यारोपण. यहाँ हम का वर्णन कैसे माउस आंख से सिलिअरी उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए और उन्हें संस्कृति में बढ़ने के क्रम में clonal रेटिना स्टेम सेल क्षेत्रों के रूप में. के बाद से वहाँ vivo में स्टेम सेल का कोई ज्ञात मार्करों हैं, इन क्षेत्रों को ही जाना जाता भावी आँख के सिलिअरी उपकला भीतर स्टेम सेल की आबादी की पहचान कर रहे हैं.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे रेटिना माउस आंख 1-3 की रोमक उपकला से स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए . रोमक उपकला की स्ट्रिप्स अलग करने के लिए पद्धति में भिन्नता है, लेकिन एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एंजाइमों और पद्धति इस प्रोटोकॉल में अनुकूलित किया गया है सकते हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि रोमक उपकला के स्ट्रिप्स पृथक किया गया है कि RPE या कॉर्निया की बड़ी मात्रा में शामिल नहीं है क्योंकि इन क्षेत्रों है कि हर आंख से अलग किया जा सकता है है की कुल संख्या पर एक नकारात्मक प्रभाव पड़ता है प्रकट करते हैं. इसके अलावा, सीरम स्वतंत्र मीडिया है कि हम है कि मूल रूप से मस्तिष्क neurospheres 13 के लिए तैयार की गई थी, रेटिना स्टेम सेल क्षेत्रों से बढ़ के लिए आदर्श है. एक भी यकीन है कि कोशिकाओं के बाद वे मढ़वाया गया है और इनक्यूबेटर में रखा ताकि बढ़ती क्षेत्रों को एक साथ नहीं कुल 14 करते परेशान नहीं कर रहे हैं बनाना चाहिए.
एक बार रेटिना स्टेम कोशिकाओं clonal क्षेत्रों का गठन किया है, वे आंख प्रति स्टेम कोशिकाओं का एक संभावित संख्या प्राप्त करने के लिए गिना जा सकता है. क्षेत्रों तब तो एकल कक्षों में अलग किया जा सकता है और पता लगाने आत्म नवीकरण क्षमताओं के लिए passaged या तंत्रिका रेटिना और RPE वृद्धि कारकों के विभिन्न संयोजनों और / या प्रोटीन के उपयोग के विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विभेदित.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लौरा क्लार्क उसे अमूल्य सहायता के लिए धन्यवाद. स्टेम सेल नेटवर्क, CIHR और NIH: यह काम NCE द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
| Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
| Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
| Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
| #7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
| #5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
| Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
| #3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
| #10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
| Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
| Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
| Trypsin | Sigma | T1005 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
| Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
| Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
| 35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
| 24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
| Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
| 14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
| Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
| FGF2 | Sigma | F0291 | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |
References
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