En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.
La célula madre de la retina de ratones adultos (RSC) es una célula poco de reposo se encuentran en el epitelio ciliar (CE) del ojo de los mamíferos 1,2,3. La CE está compuesto por no pigmentados capas de células pigmentadas interior y exterior, y las colonias clonal RSC que surgen de una sola célula pigmentada de la CE se compone de dos células pigmentadas y no pigmentadas que se pueden diferenciar para formar todos los tipos de células de la retina neural y el EPR. Existe cierta controversia sobre si todas las células dentro de las esferas contienen al menos algo de pigmento 4, pero las células son todavía capaces de formar los tipos de células diferentes que se encuentran dentro de la retina neural 1-3. En algunas especies, como los anfibios y los peces, sus ojos son capaces de regenerarse después de una lesión 5, sin embargo, el ojo de los mamíferos no muestra propiedades regenerativas tales. Tratamos de identificar las células madre in vivo y para comprender los mecanismos que impiden que las células madre de la retina de mamíferos en reposo 6-8, incluso después de la lesión, así como su uso como una fuente potencial de células para ayudar a reparar los modelos físicos o genéticos de la lesión en el ojo a través del trasplante 9-12. Aquí se describe cómo aislar las células epiteliales ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo con el fin de formar la retina esferas clonal de células madre. Dado que no existen marcadores conocidos de las células madre in vivo, estos ámbitos son la única forma conocida para identificar de manera prospectiva la población de células madre en el epitelio ciliar del ojo.
Este protocolo describe cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo con el ratón 3.1. La metodología para el aislamiento de las tiras de epitelio ciliar puede variar, sin embargo, las enzimas y la metodología para la consecución de una suspensión de una sola célula han sido optimizados en este protocolo. También es importante que las tiras de epitelio ciliar que han sido aisladas no contienen grandes cantidades de RPE o de la córnea, ya que estos parecen tener un impacto negativo en el número total de esferas que pueden ser aislados de cada ojo. Además, los medios de comunicación libres de suero que hacemos que se formuló originalmente para el cerebro neuroesferas 13, es ideal para el cultivo de la retina esferas de células madre. También hay que asegurarse de que las células no se alteran después de que se han plateado y se colocan en la incubadora para que los ámbitos de crecimiento no se agregan juntos 14.
Una vez que las células madre de la retina se han formado las esferas clonal, que se puede contar para obtener un número potencial de células madre por ojo. Las esferas se pueden disociarse en células individuales y se pasaron a conocer la renovación capacidades de auto-o diferenciarse en diferentes tipos de células de la retina neural y el EPR usando diferentes combinaciones de factores de crecimiento y / o proteínas.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Laura Clarke por su inestimable ayuda. Este trabajo es apoyado por la economía neoclásica: la Red de Células Madre, CIHR y los NIH.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |