Isolering av näthinnan stamceller från mus Eye

Summary

I den här videon kommer vi att visa hur man kan isolera näthinnans stamceller från ciliära epitelet av musen ögat och odla dem i kultur för att bilda klonat näthinnan sfärer. De områden som är isolerade har kardinalen egenskaper stamceller: självförnyelse och multipotentiality.

Abstract

Den vuxna musen retinala stamceller (RSC) är en sällsynt rofylld cell finns inom ciliära epitelet (CE) av däggdjur ögat ^1,2,3. CE består av icke-pigmenterade inre och pigmenterade yttre cellager och klonal RSC kolonier som uppstår från en enda pigmenterad cell från CE består av både pigmenterade och icke-pigmenterade celler som kan differentieras för att bilda alla celltyper av neurala näthinnan och RPE. Det finns en viss kontrovers om huruvida alla celler inom de områden alla innehålla åtminstone några pigment ^4, men cellerna finns fortfarande i stånd att bilda olika celltyper som finns inom neurala näthinnan ^1-3. Hos vissa arter, såsom groddjur och fiskar, deras ögon kan regeneration efter skada ^5, dock, däggdjur ögat visar inga sådana regenerativ egenskaper. Vi strävar efter att identifiera de stamceller in vivo och att förstå de mekanismer som håller däggdjursceller näthinnans stamceller vilande ^6-8, även efter skada och använder dem som en potentiell källa av celler för att reparera fysiska eller genetiska modeller av ögonskada genom transplantation ^9-12. Här beskriver vi hur du kan isolera strålkroppen epitelceller från mus ögat och odla dem i kultur för att bilda klonal näthinnans sfärerna stamceller. Eftersom det inte finns några kända markörer för stamceller in vivo, dessa områden är de enda kända sättet att prospektivt identifiera befolkningen stamceller inom ciliära epitelet i ögat.

Protocol

1. Förbered Analysera lösningar och lösningar Enzyme Gör Konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) och serumfritt Media förväg och kyla. Väg ut kynurensyra (0,2 mg / ml) och lös i 10 ml Hilo ACSF i ett 37 ° C vattenbad i förväg eftersom den inte löses upp lätt. Väg ut Trypsin (1,33 mg / ml) och Hyaluronidas (0,67 mg / ml) och placera i en 15 ml tub och hålla det vid -20 ° C tills det behövs. Tillsätt kynurensyra lösningen på detta rör och filter med hjälp av en 22-filter ìm sprutan strax före användning. Väg trypsininhibitorerna (Ovamucoid: 1 mg / ml) och lös i varmt serumfritt Media och filtret med 22μm spruta filter. Gör plätering media: serumfritt Medier som innehåller FGF2 (10 ng / ml) och Heparin (2 mikrogram / ml). 2. Isolera näthinnan stamceller från mus Eye Isolering av näthinnans stamceller sker i en specifik sterilt rum tillägnat primära kultur experiment. Innan start detta förfarande ställa in dissekera mikroskop och kall-ljuskälla, och sedan lägga ut den sterila dissekera instrument. Varje Huvan har ett hett pärla autoklav för sterilisering av instrumenten mellan stegen. Vi kommer att isolera retinala stamceller från ögon som har placerats direkt i en steril petriskål innehåller artificiella cerebrospinalvätska (ACSF) efter de avlägsnas från möss offrade enligt godkänd djuretik protokoll. Enligt dissekera mikroskopet, rengör ögat med pincett: bli av med hår och bindväv som är fäst på hornhinnan / skleral gränsen. Sedan överföra ögat till en ny maträtt med ACSF. Medan försiktigt hålla ögat stilla med räfflad tång, använda vinklade mikro-dissekera en sax för att ta bort den okulära musklerna. Ta bort synnerven samt om det fortfarande är fäst vid ögat. Försök att inte trycka ihop ögat under denna process. Överför ögonen för en ny maträtt med ACSF. Nästa använder böjda mikro-dissekera sax för att klippa ögat i hälften: börja på synnerven och skär genom mitten av hornhinnan, mötet tillbaka på synnerven när den kapade inleddes. Det är idealiskt om de två bitar av ögat är ungefär lika i storlek, eftersom detta kommer att göra nästa steg lättare. Håll hornhinnor med två pincett försiktigt skala två ögat halvorna isär. Ta bort och kasta linsen, inälvor, och neurala retinal från ögat skal. Överför skal till en ny maträtt med ACSF. Nu är vi redo att isolera ciliära epitelet. Till att börja orientera ögat skalet så att hornhinnan på höger och Retinal Pigmenterad (RPE) är till vänster. Försiktigt stiftet ögat skalet ner med rak pincett på RPE sidan. Nästa, använd en skalpell för att skära i hornhinnan och iris bort från ciliära epitelet i ögat genom att försiktigt trycka nedåt på skalpell istället för att använda sågning rörelser. Efter det skär ciliära epitelet bort från RPE. Använda icke-tandade pincett för att överföra remsa av ciliära epitelet till en ny 35-mm maträtt som innehåller ACSF. På samma sätt isolera ciliära epitelet från det andra ögat skalet. När båda ciliär epitelceller band har samlats in, överföra remsorna till en 35-mm maträtt innehållande 2 ml Dispase. Placera skålen med remsor i en 37 ° C inkubator i 10 minuter. Efter 10 minuter, överföring remsorna från Dispase i en skål med 2 ml filtrerad trypsin, Hyaluronidas och kynurensyra. Placera skålen vid 37 ° C i 10 minuter. Nu tillbaka till dissekera mikroskop. Håll sklera ner med rak pincett, använd botten av böjda icke-tandade pincett för att försiktigt skrapa ciliära epitelet bort från sklera. Ta bort sklera från skålen. Allt som bör vara kvar i skålen nu är de celler av intresse och enzymet lösningen. Med hjälp av en brand-polerat bomull-ansluten Överför denna lösning till en 14-ml-rör. Mal sönder denna lösning 30 gånger för att bryta isär epitelceller genom att försiktigt tvinga lösningen i och ut ur pipetten. Centrifugera röret i 5 minuter vid 1500 rpm. När centrifugeringen är klar, ta bort röret från centrifugen noggrant eftersom cellerna är benägna att komma från botten av röret i detta skede. Försiktigt aspirera majoriteten av supernatanten med en brand-polerad pipett och sedan tillsätt 1 ml av trypsin inhibitor i serum-fri media till cellerna. Använd en liten borrhål bomull ansluten pipett till mal sönder provet ungefär 50 gånger tills det är en encelliga suspension. Centrifugera röret igen i 5 minuter vid 1500 rpm. Avlägsna supernatanten och ersätta den med 1 mL din plätering medium. Kör det försiktigt med en brand-polerat glaspipett att resuspendera cellerna. Efter att räknaning av celler, plattan dem på den önskade tätheten i 24-brunnar. Vi plattan vanligen 10 celler / mikroliter genom att fylla varje brunn först med medium och sedan lägga cellsuspensionen att få en slutlig volym på 500 mikroliter av media. Placera plattan i ett 37 ° C CO 2 inkubator där den inte flyttas förrän du räkna kulor som uppstår efter 7 dagar. 3. Resultat av Isolera Retinal stamceller När detta förfarande utförs framgångsrikt, bör dissekerade strålkroppen epitelceller se ut så här efter att ha tagit avstånd och pläterade på låg densitet (Figur 1). Efter 7 dagar i kultur, är de retinala stamceller sfärer som uppstår räknas. Ett område skall vara över 75 nm i diameter och fritt flytande ska räknas som en stamcell härrör sfär. (Figur 2). Dock kommer vissa celler har begränsad spridning och form spheroids som inte uppfyller storlek kriteriet och kommer inte att räknas som stamceller härstammar cell sfärer, ett exempel på en sådan sfäroid visas här (figur 2). 4. Representativa resultat Figur 1. Figur 2.

Discussion

Detta protokoll beskriver hur man isolera näthinnans stamceller från ciliära epitelet av musen ögat ^1-3. Metoden för att isolera remsor av ciliära epitelet kan variera, men de enzymer och metodik för att uppnå en encelliga fjädring har optimerats i detta protokoll. Det är också viktigt att remsor av strålkroppen epitel som har isolerats inte innehåller stora mängder RPE eller hornhinna eftersom dessa verkar ha en negativ inverkan på det totala antalet områden som kan isoleras från varje öga. Dessutom är det serumfritt media som vi gör som ursprungligen formulerades för hjärnans neurospheres ^13, perfekt för att odla retinal sfärer stamceller. Man bör också se till att cellerna inte störs när de har pläterade och placerats i inkubatorn så att den växande sfären inte samlade ihop ^14.

När näthinnans stamceller har bildat klonat sfärer, kan de räknas för att få en prospektiv antalet stamceller per öga. Sfärerna då kan sedan skiljas i enskilda celler och passerats för att fastställa självförnyelse funktioner eller differentierade i olika celltyper i neurala näthinnan och RPE med olika kombinationer av tillväxtfaktorer och / eller proteiner.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Stemi 2000 Microscope		Zeiss
Cold Light Source		Zeiss	KL1500	dual arm optic light
Curved Mini Vannas scissors		FST	15000-10
Angled Vannas scissors		FST	15005-08
#7 Dumont forceps		FST	11272-30	non-serrated
#5 Dumont forceps		FST	11251-10	straight
Fine forceps		FST	11051-10	serrated curved
#3 Scalpel handle		Almedic	2586-M36-10
#10 Scalpel blades		Almedic	2580-M90-10
Hot Bead Sterilizer		FST	18000-45
Dispase		VWR/BD	CACB354235
Trypsin		Sigma	T1005
Hyaluronidase		Sigma	H6254
Kynurenic Acid		Sigma	K3375	1000 IU
Trypsin Inhibitor		Roche	10109878001
35 mm dishes		VWR/Nunc	CA354235
24-well plate		VWR/Nunc	CA73521-004
Cotton-plugged pipettes		VWR	14672-400	fire-polish
14 mL Tubes		Falcon	352057	Polystyrene
Serum-free Media				Ref# 13 for formulation
FGF2		Sigma	F0291
Heparin		Sigma	H3149	100 IU