من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة
Summary
وسوف نظهر الإعداد وتحليل microRNA – 96 – جيدا قبل صفائف QPCR باستخدام الروبوت وكذلك جنب مع ماصة العلمية الحرارية الأقنية ماتريكس.
Abstract
وقد برزت الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) كأداة قيمة ودقيقة في توصيف مستويات التعبير الجيني. واحدة من مزاياها العديدة هو الحد الأدنى للكشف بالمقارنة مع غيرها من أساليب التعبير الجيني التنميط أثناء استخدام كميات صغيرة من المدخلات لكل مقايسة. وقد تحسنت الآلي qPCR الإعداد هذا المجال من خلال السماح لمزيد من التكاثر. الإعداد لها مريحة وسريعة تتيح للتجارب التي مرت عالية ، مما مكن من التنميط جينات كثيرة مختلفة في وقت واحد في كل تجربة. هذا الأسلوب مع لوحة التحكم الداخلية يقلل أيضا من المتغيرات التجريبية المشتركة لتقنيات أخرى. قمنا بتطويرها مؤخرا لفحص qPCR التنميط المسبق من microRNAs (ما قبل miRNAs) باستخدام مجموعة من أزواج التمهيدي 186. ظهرت MicroRNAs كطبقة رواية صغيرة ، الرناوات غير الترميز لديهم القدرة على تنظيم العديد من الأهداف مرنا في مرحلة ما بعد النسخي. وكتب أولا هذه الرنا RNA الصغيرة بوليميريز الثاني باعتباره ميرنا الابتدائي (الحزب الثوري المؤسسي ، ميرنا) نسخة ، وهو المشقوق ثم إلى ميرنا السلائف (ما قبل ميرنا). ويتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم حيث يشق المقامر حلقة منعطف حاد لانتاج miRNAs ناضجة. ويمكن ملاحظة زيادة في مستويات ميرنا على السلائف وعلى صعيد ميرنا ناضجة والتنميط من كل من هذه الأشكال يمكن أن تكون مفيدة. هناك عدة فحوصات متوفرة تجاريا للmiRNAs ناضجة ، ولكن تكلفتها العالية قد تردع هذه التقنية الباحثين من التنميط. هنا ، نحن نناقش فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها ، وطريقة qPCR SYBR القائمة على التنميط المسبق miRNAs. التغيرات في مستويات ما قبل ميرنا غالبا ما تعكس التغييرات ميرنا ناضجة ويمكن أن تكون مؤشرا مفيدا التعبير ميرنا ناضجة. ومع ذلك ، قد التنميط المتزامن لكلا miRNAs قبل أن تنضج وmiRNAs الأمثل لأنها يمكن أن تساهم المعلومات nonredundant وتوفير نظرة ثاقبة تجهيز microRNA. وعلاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه التقنية وصفها هنا ليشمل مجموعات من التنميط مكتبة أخرى لمسارات محددة أو مسببات الأمراض.
Protocol
Discussion
QPCR هو مقايسة حساسة للغاية والتي يمكن استخدامها للمقارنة بين مستويات التعبير الجيني بين العينات في الدراسة ، وكذلك لتحديد بالفيروس في حالة من الفيروسات. الفائدة من استخدام صفائف qPCR هو القدرة على تشغيل العديد من المشارع (في حالتنا ، أزواج التمهيدي 186) لكل عينة في فترة ق…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DE018304 ، R01DE018281. معتمد من قبل KT GM07092 T32 – 34 ومنحة لجامعة ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل من معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) من خلال مبادرة متوسطية في غراد. معتمد من قبل PC T32 CA009156.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
