分析的预微RNA和小分子RNA采用实时定量PCR（定量PCR）阵列
Summary
我们将演示前的小分子RNA的设置和分析QPCR 96孔阵列以及使用机器人手用Thermo Scientific的矩阵多道移液器。
Abstract
实时定量PCR（QPCR）已成为一个准确和有价值的工具，在分析基因表达水平。它的诸多优点之一，是一个较低的检测限相比，基因表达分析等方法，同时使用，每个检测数额较小的输入。自动定量PCR安装更大的可重复性，从而改善了这一领域。它的方便和快速设置允许用于高通量实验，使许多不同的基因分析，同时在每个实验。这连同内部板控制的方法，也降低了其他技术的共同实验变量。我们最近开发的一个前小分子RNA分析的定量PCR检测（前- miRNA的），使用186个引物对。小分子RNA已成为一类新的小，非编码RNA的调节能力，在许多基因的转录后水平的目标。作为一个主要的miRNA（PRI – miRNA）的成绩单，然后到前体miRNA（预miRNA）的切割，这些小分子RNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录。预miRNA是出口到细胞质中Dicer酶切割产生成熟的miRNA发夹环。在miRNA水平的提高，可以观察到的前体和成熟的miRNA的水平都和这两种形式分析是有用的。有几种市售成熟的miRNA的检测，但其成本高，可能会阻止从这个分析技术的研究人员。在这里，我们讨论了一个具有成本效益，可靠的分析前的miRNA，基于SYBR的qPCR的方法。 miRNA的前水平的变化往往反映了成熟miRNA的变化和成熟的miRNA的表达可以是一个有用的指标。然而，同时分析前的miRNA和成熟的miRNA可能是最佳的，因为他们可以作出贡献的非冗余信息，并提供处理成小分子RNA的见解。此外，这里描述的技术可以扩展，包括具体途径或病原体的其他库集的分析。
Protocol
Discussion
QPCR是一个高度敏感的检测可以用来比较样本之间的基因表达水平，在一项研究中，以及在病毒的情况下，以确定阳性。使用的qPCR阵列的好处是每个样品许多引物（在我们的例子中，186对引物），在很短的时间内运行的能力。使用特餐自由EVO，设置可以进一步减少实验所需的时间，和机器人的准确性和一致性，如移液机器人，可以减少和消除移液错误。在这里，我们将演示如何使用特餐自由埃沃?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院拨款DE018304，R01DE018281支持。 KT公司是由T32 – 34 GM07092授予教堂山北卡罗来纳大学霍华德休斯医学研究所（HHMI）的通过MED到毕业倡议的支持。 PC支持的T32 CA009156。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
