Profilering van de Pre-micro-RNA's en microRNA's met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays
Summary
We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.
Abstract
Kwantitatieve real-time PCR (QPCR) heeft ontpopt als een nauwkeurig en waardevol instrument in de profilering van genexpressie niveaus. Een van de vele voordelen is een lagere detectiegrens in vergelijking met andere methoden van gen expressie profilering tijdens het gebruik van kleinere hoeveelheden input voor elke test. Geautomatiseerde qPCR setup is verbeterd op dit gebied door toe te staan voor een grotere reproduceerbaarheid. De handige en snelle setup zorgt voor high-throughput experimenten, waardoor de profilering van vele verschillende genen tegelijkertijd in elk experiment. Deze methode in combinatie met interne controle plaat vermindert ook de experimentele variabelen bij andere technieken. We hebben recent ontwikkelde een qPCR test voor profilering van pre-microRNA's (pre-miRNAs) met behulp van een set van 186 primer paren. MicroRNA hebben zich ontwikkeld tot een nieuwe klasse van kleine, niet-coderende RNA's met de mogelijkheid om vele doelen mRNA regelen bij de post-transcriptionele niveau. Deze kleine RNA's worden eerst getranscribeerd door RNA polymerase II als een primaire miRNA (pri-miRNA) transcriptie, die vervolgens wordt gesplitst in de voorloper miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNAs worden geëxporteerd naar het cytoplasma waar Dicer knipt de hairpin loop te geven volwassen miRNAs. Verhogingen van miRNA niveaus kunnen worden waargenomen op zowel de voorloper en volwassen miRNA niveaus en profilering van beide vormen kan nuttig zijn. Er zijn verschillende commercieel verkrijgbare assays voor de rijpere miRNAs, maar de hoge kosten kunnen afschrikken onderzoekers van deze profilering techniek. Hier bespreken we een rendabele, betrouwbare, SYBR-based qPCR methode van profiling pre-miRNAs. Veranderingen in de pre-miRNA het niveau vaak een weerspiegeling van volwassen miRNA veranderingen en kan een nuttige indicator van de volwassen miRNA expressie. Kan echter gelijktijdig profilering van zowel pre-miRNAs en volwassen miRNAs worden optimaal als ze kunnen nonredundant informatie bijdragen en geven inzicht in de verwerking van microRNA. Bovendien kan de techniek hier beschreven worden uitgebreid met de profilering van andere bibliotheek sets voor specifieke studierichtingen of ziekteverwekkers omvatten.
Protocol
Discussion
QPCR is een zeer gevoelige test die gebruikt kan worden om genexpressie niveaus te vergelijken tussen de monsters in een studie, alsook aan positiviteit te bepalen in het geval van virussen. Het voordeel van het gebruik van qPCR arrays is de mogelijkheid om vele primers (in ons geval, 186 primer paren) lopen voor elk monster in een korte periode van tijd. Met behulp van een robot pipetteren, zoals de Tecan Freedom Evo, de hoeveelheid tijd die nodig is om een experiment up kan verder worden verlaagd ingesteld, en d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie DE018304, R01DE018281. KT wordt ondersteund door T32 GM07092-34 en door een subsidie aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill van Howard Hughes Medical Institute (HHMI) door de Med in Grad Initiative. PC wordt ondersteund door T32 CA009156.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
