प्री - सूक्ष्म RNAs और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर Arrays (qPCR) का उपयोग microRNAs की रूपरेखा
Summary
हम सेटअप और पूर्व microRNA की विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे qPCR के लिए 96 अच्छी तरह से arrays के थर्मो वैज्ञानिक मैट्रिक्स multichannel विंदुक के साथ हाथ से एक रोबोट के रूप में अच्छी तरह के रूप में उपयोग.
Abstract
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) जीन अभिव्यक्ति के स्तर की रूपरेखा में एक सटीक और मूल्यवान उपकरण के रूप में उभरा है. इसके कई फायदे में से एक कम का पता लगाने जबकि प्रत्येक परख के लिए इनपुट के छोटे मात्रा का उपयोग जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के अन्य तरीकों की तुलना में सीमा है. स्वचालित qPCR सेटअप अधिक reproducibility के लिए अनुमति देकर इस क्षेत्र में सुधार हुआ है. इसकी सुविधाजनक है और तेजी से सेटअप उच्च throughput प्रयोगों के लिए अनुमति देता है, एक साथ कई अलग अलग जीनों की रूपरेखा प्रत्येक प्रयोग में सक्षम करने. आंतरिक प्लेट नियंत्रण के साथ साथ यह विधि भी प्रायोगिक अन्य तकनीकों के लिए आम चर कम कर देता है. हमने हाल ही में पूर्व microRNAs की रूपरेखा के लिए एक qPCR परख (miRNAs पूर्व) 186 प्राइमर जोड़े का एक सेट का उपयोग कर विकसित किया है. MicroRNAs बाद transcriptional स्तर पर कई mRNA लक्ष्य को विनियमित करने की क्षमता के साथ छोटे, गैर कोडन RNAs के एक उपन्यास वर्ग के रूप में उभरा है. इन छोटे RNAs पहली बार एक प्राथमिक (प्राथमिक miRNA) miRNA प्रतिलेख, जो तब अग्रदूत miRNA (पूर्व miRNA) में cleaved है के रूप में शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित. पूर्व miRNAs cytoplasm जहां पासा खेलनेवाला बाल के लिये कांटा पाश cleaves परिपक्व miRNAs उपज के लिए निर्यात कर रहे हैं. MiRNA के स्तर में वृद्धि दोनों अग्रदूत और परिपक्व miRNA स्तर इन दोनों रूपों के की रूपरेखा पर देखा जा सकता है उपयोगी हो सकता है. परिपक्व miRNAs के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध assays हैं, तथापि, अपने उच्च लागत इस रूपरेखा तकनीक से शोधकर्ताओं को रोकते हो सकता है. यहाँ, हम एक लागत प्रभावी, विश्वसनीय, पूर्व miRNAs रूपरेखा के SYBR आधारित qPCR विधि पर चर्चा की. पूर्व miRNA के स्तर में परिवर्तन अक्सर परिपक्व miRNA परिवर्तनों को प्रतिबिंबित करने और परिपक्व miRNA अभिव्यक्ति का एक उपयोगी सूचक हो सकता है. हालांकि, दोनों पूर्व miRNAs और परिपक्व miRNAs के साथ – साथ रूपरेखा इष्टतम के रूप में वे nonredundant जानकारी के योगदान और microRNA प्रसंस्करण में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं हो सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक यहाँ वर्णित विशिष्ट रास्ते या रोगजनकों के लिए अन्य लायब्रेरी सेट की रूपरेखा धरना विस्तारित किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
QPCR एक बेहद संवेदनशील परख है कि नमूनों के बीच एक अध्ययन में जीन की अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वायरस के मामले में धनात्मकता निर्धारि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच DE018304 अनुदान, R01DE018281 द्वारा समर्थित किया गया. के.टी. T32 GM07092-34 और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल मेड के माध्यम से (HHMI) ग्रैड पहल में संस्थान से चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित है. पीसी T32 CA009156 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
