Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array
Summary
Dimostreremo la configurazione e l'analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.
Abstract
Quantitativa real-time PCR (QPCR) è emerso come uno strumento preciso e prezioso nel profilo livelli di espressione genica. Uno dei suoi vantaggi è un limite di rilevazione più basso rispetto ad altri metodi di profili di espressione genica durante l'utilizzo di piccole quantità di ingresso per ciascun test. Automatizzate di configurazione qPCR ha migliorato questo settore, consentendo una maggiore riproducibilità. La sua configurazione comoda e rapida permette di high-throughput esperimenti, che consente la profilazione di molti geni diversi simultaneamente in ogni esperimento. Questo metodo insieme ai controlli piastra interna riduce anche variabili sperimentali comuni ad altre tecniche. Abbiamo recentemente sviluppato un test qPCR per la profilatura di pre-microRNA (pre-miRNA) utilizzando un set di 186 coppie di primer. I microRNA sono emersi come una nuova classe di piccoli RNA non codificanti, con la possibilità di regolare molti mRNA target a livello post-trascrizionale. Questi piccoli RNA vengono prima trascritti dalla RNA polimerasi II come un miRNA primario (pri-miRNA) trascrizione, che viene poi tagliata in miRNA precursore (pre-miRNA). Pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma dove Dicer unirà il ciclo tornante cedere miRNA maturi. Aumenti dei livelli di miRNA possono osservare sia il precursore e livelli di miRNA maturo e profilatura di entrambe queste forme possono essere utili. Ci sono diversi test disponibili in commercio per il miRNA maturo, ma il loro costo elevato potrebbe scoraggiare i ricercatori questa tecnica di profilatura. Qui, si discute una soluzione conveniente, affidabile, SYBR metodo basato qPCR di profili pre-miRNA. Cambiamenti nei livelli di pre-miRNA spesso riflettere i cambiamenti miRNA maturo e può essere un utile indicatore di espressione miRNA maturi. Tuttavia, profilazione simultanea di entrambi i pre-miRNA e miRNA maturo può essere ottimale in quanto possono contribuire le informazioni ridondanti e permettono di percepire il trattamento di microRNA. Inoltre, la tecnica qui descritta può essere ampliata fino a comprendere la profilazione dei set di librerie per altri percorsi specifici o agenti patogeni.
Protocol
Discussion
QPCR è un saggio altamente sensibile che può essere utilizzato per confrontare i livelli di espressione genica tra i campioni in studio, e di determinare positività in caso di virus. Il vantaggio di utilizzare array qPCR è la possibilità di eseguire molti primer (nel nostro caso, 186 coppie di primer) per ogni campione in un breve periodo di tempo. Utilizzando un robot pipettamento come la libertà Tecan Evo, la quantità di tempo necessario per impostare un esperimento up può essere ulteriormente ridotto, e l'…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH DE018304, R01DE018281. KT è supportato da GM07092 T32-34 e da un finanziamento alla University of North Carolina a Chapel Hill da Howard Hughes Medical Institute (HHMI) attraverso il Med in Grad iniziativa. PC è supportato da T32 CA009156.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
