Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays
Summary
Vi kommer att visa installationen och analys av pre-mikroRNA 96-bra arrayer för QPCR med hjälp av en robot och för hand med en Thermo Scientific Matrix multikanalpipett.
Abstract
Kvantitativa realtids-PCR (QPCR) har framträtt som en korrekt och värdefullt verktyg i profileringen nivåer genuttryck. En av dess många fördelar är en lägre detektionsgräns jämfört med andra metoder för profilering av genuttryck när du använder mindre mängder av input för varje analys. Automatiserad qPCR inställning har förbättrats detta område genom att medge mer reproducerbarhet. Det bekväma och snabb installation möjliggör hög genomströmning experiment, vilket gör att profilering av många olika gener samtidigt i varje försök. Denna metod tillsammans med invändig plåt kontroller minskar också experimentella variabler gemensamma för andra tekniker. Vi nyligen utvecklat en qPCR assay för profilering av pre-mikroRNA (pre-miRNA) med en uppsättning av 186 primerpar. MikroRNA har uppstått som en ny klass av små icke-kodande RNA med möjlighet att reglera många mRNA mål på efter transkriptionella nivå. Dessa små RNA är först transkriberas av RNA-polymeras II som en primär miRNA (pri-miRNA) avskrift, som sedan klyvs i föregångaren miRNA (pre-miRNA). Pre-miRNA exporteras till cytoplasman där Dicer klyver hårnål slingan för att ge mogna miRNA. Ökningar av miRNA nivåer kan ses på både föregångare och mogna nivåer miRNA och profilering av båda dessa former kan vara användbart. Det finns flera kommersiellt tillgängliga analysmetoder för mogna miRNA, men kan deras höga kostnader avskräcker forskare från denna profilering teknik. Här diskuterar vi en kostnadseffektiv, pålitlig, SYBR baserad qPCR metod för profilering pre-miRNA. Förändringar i pre-miRNA avspeglar ofta mogna miRNA förändringar och kan vara en värdefull indikator på mogna miRNA uttryck. Däremot kan samtidig profilering av både pre-miRNA och mogna miRNA vara optimal eftersom de kan bidra nonredundant information och ge insikt i mikroRNA bearbetning. Dessutom kan den teknik som beskrivs här att utökas till att omfatta profilering av andra bibliotek satser för specifika vägar eller patogener.
Protocol
Discussion
QPCR är en mycket känslig analysmetod som kan användas för att jämföra nivåer genuttryck mellan proverna i en studie, samt att bestämma positivitet i händelse av virus. Fördelen med att använda qPCR matriser är möjligheten att köra många primers (i vårt fall, 186 primerpar) för varje prov i en kort tid. Med hjälp av en pipett robot som Tecan Frihet Evo, den tid som krävs för att ställa ett experiment upp kan minskas ytterligare, och noggrannheten och konsekvensen i roboten kan minska och eliminera p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH bidrag DE018304, R01DE018281. KT stöds av T32 GM07092-34 och genom ett stipendium till University of North Carolina i Chapel Hill från Howard Hughes Medical Institute (HHMI) genom Med i Grad Initiative. PC stöds av T32 CA009156.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
