Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) Diziler kullanarak Pre-mikro RNA'lar ve microRNA, Profilleme
Summary
Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.
Abstract
Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), gen ekspresyon düzeyleri profil doğru ve değerli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Birçok avantajlarından biri, her bir deney için küçük miktarlarda girişi kullanırken gen ekspresyon profil diğer yöntemlere göre daha düşük bir algılama sınırı. Otomatik qPCR kurulum büyük tekrarlanabilirlik için izin vererek bu alanda geliştirdi. Her bir deney için aynı anda pek çok farklı genler profil sağlayan, kullanışlı ve hızlı kurulum, yüksek verimlilik deneyler için sağlar. Bu yöntem aynı zamanda iç plaka kontrolleri ile birlikte diğer tekniklerin ortak deneysel değişkenler azaltır. Biz son zamanlarda bir dizi 186 primer çiftleri kullanarak ön microRNA profil qPCR assay (ön miRNA'ların) geliştirdi. MicroRNA yeteneği ile birçok mRNA transkripsiyon sonrası seviyede hedefler düzenlemek için küçük, non-coding RNA'ların bir roman sınıf olarak ortaya çıkmıştır. Bu küçük RNA'lar sonra habercisi miRNA (pre-miRNA) bölünmüş bir birincil miRNA (pri-miRNA) transkript, ilk olarak, RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu. Ön-miRNA'lar Dicer olgun miRNA'lar verim saç tokası döngü parçalayarak sitoplazma ihraç edilmektedir. MiRNA düzeylerde artışlar yararlı olabilir, hem de bu formları habercisi ve olgun miRNA düzeyleri ve profil hem görülebilir. Olgun miRNA'lar için piyasada bulunan birçok deneyleri vardır; bununla birlikte, yüksek maliyetli bu profil tekniği araştırmacılar caydırıcı olabilir. Burada, ön miRNA'lar profil maliyet-etkin, güvenilir, SYBR tabanlı qPCR yöntemi tartışacağız. -MiRNA öncesi düzeylerinde değişiklikler genellikle olgun miRNA değişiklikleri yansıtmak ve olgun miRNA ifade yararlı bir göstergesi olabilir. Yedeksiz bilgi katkıda bulunmak ve microRNA işleme içgörü sağlayabilir Ancak, pre-miRNA'lar ve olgun miRNA'lar hem de eş zamanlı olarak profil optimal olabilir. Ayrıca, burada açıklanan tekniği, özel yollar veya patojenler için diğer kütüphane setleri profil kapsayacak şekilde genişletilebilir.
Protocol
Discussion
QPCR çok hassas bir çalışma örnekleri arasında gen ekspresyon düzeylerini karşılaştırmak için kullanılabilir testinin yanı sıra virüs durumda pozitifliği belirlemek için. QPCR dizileri kullanmanın yararı zaman kısa bir süre içinde her bir örnek için birçok primerler (bizim durumumuzda, astar 186 çift) çalıştırma yeteneği. Tecan Özgürlük Evo kadar azaltılmış olabilir bir deney ayarlamak için gerekli süreyi, ve robot doğruluk ve tutarlılık gibi bir pipetleme robot kullanarak pipe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe DE018304, R01DE018281 tarafından desteklenmiştir. KT T32 GM07092-34 ve Grad Girişimi, Akdeniz ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi bir hibe ile desteklenmektedir. PC T32 CA009156 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips – Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
