Profiling von Pre-micro RNAs und microRNAs mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) Arrays
Summary
Wir zeigen den Aufbau und die Analyse der Vor-microRNA 96-well-Arrays für die qPCR mit einem Roboter als auch von Hand mit einem Thermo Scientific Matrix Mehrkanalpipette.
Abstract
Quantitative real-time PCR (qPCR) ist als eine genaue und wertvolle Hilfe in der Profilierung der Genexpression Ebenen entstanden. Einer der vielen Vorteile ist eine untere Nachweisgrenze im Vergleich zu anderen Methoden der Genexpressions-Profiling bei der Verwendung kleiner Mengen von Input für jeden Test. Automatisierte qPCR Setup hat auf diesem Gebiet, indem sie für höhere Reproduzierbarkeit verbessert. Dank der günstigen und schnellen Aufbau ermöglicht Hochdurchsatz-Experimenten, so dass die Profilierung von vielen verschiedenen Genen gleichzeitig in jedem Experiment. Diese Methode zusammen mit internen Platte steuert reduziert auch experimentelle Variablen gemeinsam mit anderen Techniken. Wir haben vor kurzem entwickelte eine qPCR-Assay für die Profilierung von pre-microRNAs (pre-miRNAs) mit einem Satz von 186 Primerpaare. MicroRNAs haben als eine neue Klasse von kleinen, nicht-kodierende RNAs mit der Fähigkeit, viele mRNA-Ziele in der post-transkriptioneller Ebene regulieren entstanden. Diese kleinen RNAs werden zunächst durch RNA-Polymerase II als primäres miRNA (pri-miRNA) Transkript, die dann in die Vorläufer miRNA (pre-miRNA) gespalten wird transkribiert. Pre-miRNAs sind in das Zytoplasma, wo Dicer spaltet die Haarnadelschleife zu reifen miRNAs Ertrag exportiert. Erhöht in miRNA Ebenen können sowohl die Vorstufe und reifen miRNA Ebenen und Profilierung der beiden Formen beobachtet werden kann sinnvoll sein. Es gibt mehrere kommerziell erhältliche Assays für die reife miRNAs, aber ihre hohen Kosten können die Forscher von diesem Profiling-Technik abzuschrecken. Hier diskutieren wir eine kostengünstige, zuverlässige und SYBR-basierte qPCR-Methode des Profiling pre-miRNAs. Änderungen in pre-miRNA Ebenen spiegeln oft reife miRNA Änderungen und kann ein nützlicher Indikator für reife miRNA-Ausdruck sein. Allerdings kann die gleichzeitige Profilierung sowohl pre-miRNAs und reifen miRNAs optimal sein, da sie nicht-redundanten Informationen können dazu beitragen und geben Einblick in microRNA Verarbeitung. Darüber hinaus kann die hier beschriebene Technik erweitert, um die Profilierung der anderen Bibliothek Sets für spezifische Signalwege oder Krankheitserreger umfassen.
Protocol
Discussion
QPCR ist ein hochempfindliches Verfahren, die zur Genexpression zwischen den Proben vergleichen in einer Studie werden können, sowie Positivität im Falle von Viren zu bestimmen. Der Vorteil der Verwendung von qPCR-Arrays ist die Fähigkeit, viele Primer (in unserem Fall, 186 Primerpaare) für jede Probe laufen in einem kurzen Zeitraum. Mit einem Pipettierroboter wie die Tecan Freedom EVO, der viel Zeit benötigt, um ein Experiment zu weiter reduziert werden kann, festgelegt, und die Genauigkeit und Konsistenz des Robo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt DE018304, R01DE018281 unterstützt. KT wird durch T32 GM07092-34 und durch einen Zuschuss an die University of North Carolina at Chapel Hill vom Howard Hughes Medical Institute (HHMI) durch die Med in Grad Initiative unterstützt. PC wird durch T32 CA009156 unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan | 30017587 | ||
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Scientific | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) | |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Scientific | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) | |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche | 04 707 516 001 | ||
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche | 05015243001 | 384-well version | |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 04729749001 | ||
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche | 04729757001 | ||
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche | 05075122001 | ||
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
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- O’hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
