Analys av Schwann-astrocyternas interaktioner Använda In Vitro Analyser
Summary
Denna artikel avser att beskriva stegvis de vanligaste<em> In vitro</em> Test som används för att studera Schwann cell-asrtocyte interaktioner.
Abstract
Schwann celler är en av de vanligaste cellerna i reparation strategier efter ryggmärgsskador. Schwann celler kan stödja axonal regeneration och spirande genom att utsöndra tillväxtfaktorer 1,2 och ger tillväxtfrämjande adhesionsmolekyler 3 och extracellulära molekyler matrix 4. Dessutom har de myelinate de demyelinated axoner på platsen för skadan 5.
Men efter transplantation, inte migrera Schwann celler inte från platsen för implantatet och inte blandas med värd astrocyter 6,7. Detta resulterar i bildandet av en skarp gräns mellan Schwann celler och astrocyter, vilket skapar ett hinder för växande axoner försöker avsluta ympa tillbaka till värdvävnaden proximalt och distalt. Astrocyter i kontakt med Schwann celler genomgår också hypertrofi och upp-reglera hämmande molekyler 8-13.
In vitro-analyser har använts för att modellera Schwann cell-astrocyternas interaktioner och har varit viktiga för att förstå mekanismen bakom den cellulära beteende.
Dessa in vitro omfattar gräns-analysen, där en co-kultur är gjord med hjälp av två olika celler med varje celltyp ockuperar olika territorier med endast en liten klyfta som skiljer de två cellen fronter. Eftersom cellerna dela sig och migrera, de två cellulära fronter komma närmare varandra och till slut kolliderar. Detta gör att beteendet hos de två cellpopulationer som ska analyseras vid gränsen. En annan variant av samma teknik är att blanda de två cellpopulationer i kultur och över tid de två celltyperna segregera med Schwann celler hopklumpade tillsammans som öar i mellan astrocyter tillsammans skapa flera Schwann-astrocyternas gränser.
Den andra analysen som används för att studera samspelet mellan två celltyper är övergången analysen där cellulära rörelse kan spåras på ytan av den andra celltypen monolager 14,15. Denna analysmetod är allmänt känd som inverterad täckglas analys. Schwann celler odlas på små glasbitar och de är inverterad nedåt på ytan av astrocyternas monolager och migration bedöms från kanten av täckglas.
Båda analyserna har varit avgörande för att studera mekanismer involverade i cellulära utslagning och gränsen bildas. Några av de molekyler som identifierats med hjälp av dessa tekniker är N-Cadherins 15, kondroitin proteoglykaner (CSPGs) 16,17, FGF / Heparin 18, Ef / Ephrins 19.
Denna artikel avser att beskriva gränsen analys och migration test på stegvis och belysa de eventuella tekniska problem som kan uppstå.
Protocol
Discussion
De analyser som beskrivs ovan har använts i olika studier som visar betydelsen av flera faktorer som bidrar till gränsen bildas mellan Schwann-astrocyter och begränsad Schwann cell migration i astrocytic miljö.
Att förstå mekanismerna bakom dessa händelser är nödvändigt eftersom det skulle möjliggöra utveckling av strategier för att optimera och förbättra integreringen av schwanncell transplantat efter transplantation och därmed underlätta avfarten från regenererande axoner…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Philippa Warren för hennes vänliga hjälp.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | ||
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | ||
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | ||
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | ||
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | ||
| Forskolin | Calbiochem | 344273 | ||
| Coverlips | VWR-International | 631-0149 | ||
| Coverlips(rectangle) | MENZEL-GLASER (Supplied by Thermo Scientifics) | BB022050A1 | ||
| Chamber slides | Nunc-LabTek | 177380 | ||
| 4 well plates, 6 well plates | Nunc | 4 well plates 6 well plates |
||
| rat p75 antibody | Millipore, Temecula,California | MAB365 | ||
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | ||
| Secondary antibodies (Alexa-conjugated) | Invitrogen | A-11004 A-11034 |
Goat anti mouse 568 Goat anti Rabbit 488 |
|
| Secondary biotinylated | Vector | Goat anti mouse | ||
| DAB tablets | Sigma-aldrich | D4418 | ||
| ABC elite kit | Vector | PK-6100 | ||
| Fine Forceps | FST | 11295-10 | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6168 | ||
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
References
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells. J Anat. 204, 25-31 (2004).
- Reichardt, L. F. Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces. Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).
- Chiu, A. Y., Monteros, ., Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture. Glia. 4, 11-24 (1991).
- Blakemore, W. F. Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve. Nature. 266, 68-69 (1977).
- Andrews, M. R., Stelzner, D. J. Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord. J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).
- Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival. Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).
- Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
- Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter. Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Astrocyte-Schwann cell interactions in culture. Glia. 11, 367-377 (1994).
- Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures. Glia. 14, 145-152 (1995).
- Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface. Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).
- Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord. Brain Res. 277, 175-180 (1983).
- Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells. Dev Biol. 171, 1-15 (1995).
- Wilby, M. J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes. Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).
- Grimpe, B. The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces. Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced. Glia. , (2010).
- Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis. J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).
- Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling. J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).
