Первичных клеточных культур из Drosophila Гаструла Эмбрионы
Summary
Мы предоставляем подробный протокол для подготовки первичных элементов отделены от<em> Drosophil</em> Эмбрионов. Способность осуществлять эффективное возмущение RNAi, вместе с другими молекулярными, биохимические и клеточные методы визуализации позволит разнообразие вопросов, которые будут рассмотрены в<em> Drosophila</em> Первичные клетки.
Abstract
Здесь мы опишем способ получения и культивирования первичных элементов отделены от эмбрионов дрозофилы гаструлы. Короче говоря, большое количество постановочных эмбрионов из молодых и здоровых мух собираются, стерилизовать, а затем физически распадается на суспензии отдельных клеток с использованием стеклянного гомогенизатора. После того, как при посеве на культуру пластин или камеры слайды на соответствующей плотности в культуральной среде, эти клетки могут дифференцироваться в дальнейшем несколько морфологически-различных типов клеток, которые могут быть определены их специфические маркеры клеток. Кроме того, даны условия для лечения этих клеток с двухцепочечной (DS) для выявления РНК гена нокдаун. Эффективное RNAi у дрозофилы первичных элементов осуществляется просто купание клеток в дсРНК содержащей культуральной среде. Способность осуществлять эффективное возмущение RNAi, вместе с другими молекулярными, биохимических, клеточных анализ изображений, позволит разнообразные вопросы, требующие ответа у дрозофилы первичных элементов, особенно связанных с дифференцированным мышц и нервных клеток.
Protocol
Discussion
Развития, структура первичной культуры клеток дрозофилы может сильно варьироваться, возможно из-за нескольких переменных во время первичного процесса подготовки клетки. Прежде всего, мух для откладки яиц должна быть молодым (в течение недели назад) и здоровый (без вирусной или ба?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB была поддержана Дэймон Руньона Cancer Research стипендии Фонда DRG-1716-02. JZ была поддержана NIH / NIGMS стипендий F32 GM082174-02. Н. П. является следователь Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Laboratory culture of Drosophila. , 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
