Primaire celculturen van Drosophila Gastrula Embryo's
Summary
Wij bieden een gedetailleerd protocol voor het bereiden van primaire cellen los van<em> Drosophil</em> Een embryo's. De mogelijkheid om het uitvoeren van de effectieve RNAi verstoring, samen met andere moleculaire, biochemische en cell imaging methoden zal een aantal vragen die moeten worden aangepakt<em> Drosophila</em> Primaire cellen.
Abstract
Hier beschrijven we een methode voor het bereiden en het kweken van primaire cellen los te zien van Drosophila gastrula embryo's. Kortom, een grote hoeveelheid geënsceneerde embryo's van jonge en gezonde vliegen zijn verzameld, gesteriliseerd en vervolgens fysiek gescheiden in een enkele celsuspensie met een glazen homogenisator. Na te zijn uitgeplaat op kweekplaten of kamer dia's op een passende dichtheid in een kweekmedium, kunnen deze cellen verder te differentiëren in verschillende morfologisch-verschillende soorten cellen, die kunnen worden geïdentificeerd door hun specifieke cel-markers. Daarnaast presenteren we de voorwaarden voor de behandeling van deze cellen met dubbelstrengs (ds) RNA's tot gen knockdown te lokken. Efficiënte RNAi in Drosophila primaire cellen wordt bereikt door simpelweg het wassen van de cellen in dsRNA-bevattende kweekmedium. De mogelijkheid om uitvoering van een doeltreffend RNAi verstoringen, samen met andere moleculaire, biochemische, cell imaging analyses, zal een groot aantal vragen worden beantwoord in Drosophila primaire cellen, in het bijzonder die met betrekking tot gedifferentieerde spier-en neuronale cellen.
Protocol
Discussion
De ontwikkeling patroon van primaire culturen van Drosophila-cellen kan sterk variëren, mogelijk als gevolg van de verschillende variabelen tijdens de primaire cel voorbereidingsproces. Allereerst vliegen gebruikt voor eieren leggen moet worden jonge (binnen een week oud) en gezond (vrij van virale of bacteriële infectie). Onbevruchte of geïnfecteerde embryo's moet worden vermeden, want ze zijn nutteloos en cellen afkomstig van die embryo's niet kan onderscheiden en zal alleen overleven voor 1-2 dage…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB werd gesteund door de Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-1702. JZ werd ondersteund door NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02. NP is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Laboratory culture of Drosophila. , 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
