Primära cellkulturer från Drosophila Gastrula Embryon
Summary
Vi erbjuder ett detaljerat protokoll för att förbereda galvaniska element skiljas från<em> Drosophil</em> En embryon. Möjligheten att genomföra effektiva RNAi störning, tillsammans med andra molekylära, biokemiska och cell imaging metoder kan en mängd frågor som skall behandlas i<em> Drosophila</em> Primära celler.
Abstract
Här beskriver vi en metod för att förbereda och odling primärceller skiljas från Drosophila gastrula embryon. I korthet, iscensatte en stor mängd embryon från unga och friska flugor samlas, steriliseras och sedan fysiskt dissocierade till en enda cell suspensionen med hjälp av ett glas homogeniseringsapparat. Efter att ha pläterade på odlingsplattor eller diabilder kammare vid en lämplig täthet i ett odlingsmedium kan dessa celler differentiera vidare i flera morfologiskt-olika celltyper, som kan identifieras genom sina specifika cell markörer. Dessutom presenterar vi förutsättningar för att behandla dessa celler med dubbla strandsatta (DS) RNA att framkalla gen knockdown. Effektiv RNAi i Drosophila galvaniska element åstadkoms genom att helt enkelt bada cellerna i dsRNA innehållande odlingsmedium. Möjligheten att genomföra effektiva RNAi störning, tillsammans med andra molekylära, biokemiska, cell imaging analyser, kommer att möjliggöra en mängd olika frågor som skall besvaras i Drosophila galvaniska element, särskilt de som rör differentierade muskler och neuronala celler.
Protocol
Discussion
Utvecklingsarbetet mönster av primära kulturer av Drosophila celler kan variera mycket, möjligen på grund av flera variabler under den primära celler beredningsprocessen. Först av allt, flugor som används för äggläggning bör vara unga (inom en vecka gammal) och friska (fria från virus-eller bakterieinfektion). Obefruktade eller infekterade embryon måste undvikas, eftersom de är värdelösa och celler från dessa embryon inte kan skilja och kommer bara överleva 1-2 dagar. För det andra, under hom…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JB fick stöd av Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship DRG-1716-02. JZ fick stöd av NIH / NIGMS Fellowship F32 GM082174-02. NP är en utredare från Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S3652 | ||
| Fetal bovine serum | JRH Biosciences | 12103-500M | ||
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I-6634 | ||
| Large embryo collection cages | Genesee Scientific | 59-101 | ||
| #25 US standard testing sieve | VWR | 57334-454 | ||
| #45 US standard testing sieve | VWR | 57334-462 | ||
| #120 US standard testing sieve | VWR | 57334-474 | ||
| Dounce tissue grinder, Wheaton 7 mL | VWR | 62400-620 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0040 | ||
| Dounce tissue grinder,Kontes 40 mL | VWR | KT885300-0100 | ||
| Costar, 384-well plate | VWR | 29444-078 | ||
| Lab-Tek II Chambered coverglass | Fisher Scientific | 171080 |
References
- Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Laboratory culture of Drosophila. , 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
