Visualisation des intermédiaires de réplication induite par les UV dans les E. coli En utilisant deux dimensions agarose gel Analyse
Summary
Nous présentons une procédure par laquelle deux dimensions agarose gel d'analyse peuvent être utilisés pour identifier la structure des intermédiaires de réplication qui se produisent après irradiation UV.
Abstract
Réplication inexacte dans la présence de dommages à l'ADN est responsable de la majorité des réarrangements cellulaires et mutagenèse observée dans tous les types de cellules et est largement perçue comme étant directement associés au développement du cancer chez les humains. Dommages à l'ADN, telles que celle induite par une irradiation UV, altère sévèrement la capacité de réplication de dupliquer le modèle génomique précision. Un certain nombre de produits de gènes ont été identifiés qui sont nécessaires lorsque la réplication rencontres lésions de l'ADN dans le modèle. Toutefois, un défi reste a été de déterminer comment ces protéines lésions processus lors de la réplication<em> In vivo</em>. En utilisant Escherichia coli comme système modèle, nous décrivons une procédure dans laquelle deux dimensions agarose gel d'analyse peuvent être utilisés pour identifier les intermédiaires structuraux qui surviennent sur des plasmides répliquant<em> In vivo</em> Suivantes dommages à l'ADN induites par les UV. Cette procédure a été utilisée pour démontrer que fourches de réplication bloquées par UV des dommages induits par subir une inversion transitoire qui est stabilisé par RecA et de produits de gènes de plusieurs associé à la filière RecF. La technique démontre que ces intermédiaires de réplication sont maintenues jusqu'à une époque qui correspond à l'élimination des lésions par réparation par excision de nucléotides et reprend la réplication.
Protocol
Discussion
Les résultats typiques obtenus à partir de cellules de type sauvage en présence et en absence de rayonnement UV-induite dégâts sont présentés dans la figure 1. En l'absence de dégâts, environ 1% de l'ADN plasmidique totale peut être trouvée dans l'arc Y lorsque les cellules sont en croissance rapide dans la phase exponentielle. Après irradiation, une augmentation transitoire de molécules en forme de Y est observé que les fourches de réplication bloquées s'accumuler aux sites endommagés. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail dans notre laboratoire est soutenu par MCB0551798 bourse de carrière de la Fondation nationale des sciences et AREA octroi R15GM86839 du NIGMS-NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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