Visualisering av UV-inducerade replikering mellanprodukter i E. coli Med hjälp av två-dimensionell agaros-gel Analys
Summary
Vi presenterar ett förfarande genom vilket tvådimensionella agarose-gel analys kan användas för att identifiera struktur replikering intermediärer som sker efter UV-bestrålning.
Abstract
Felaktiga replikering i närvaro av DNA-skador är ansvarig för huvuddelen av cellulära omorganiseringar och mutagenes observerats i alla celltyper och är allmänt anses vara direkt förknippade med utveckling av cancer hos människor. DNA-skador, till exempel sådan som orsakas av UV-strålning, försämrar kraftigt möjligheterna för replikering för att duplicera genomiska mallen korrekt. Ett antal genprodukter har identifierats som är nödvändiga vid replikering möten DNA-skador i mallen. Har dock en kvarstående utmaningen varit att avgöra hur dessa proteiner processen lesioner vid replikering<em> In vivo</em>. Använda Escherichia coli som modellsystem, beskriver vi ett förfarande där två-dimensionella agarose-gel analys kan användas för att identifiera de strukturella intermediärer som uppstår på replikerar plasmider<em> In vivo</em> Efter UV-inducerade DNA-skador. Detta förfarande har använts för att påvisa att replikering gaffel blockerad av UV-inducerade skador genomgå en övergående omsvängning som stabiliseras av RecA och flera genprodukter i samband med RecF väg. Tekniken visar att dessa replikering intermediärer bibehålls tills en tid som korrelerar med avlägsnande av lesioner genom nukleotid excision reparation och återupptar replikering.
Protocol
Discussion
Typiska resultat från vildtyps celler i närvaro och frånvaro av UV-inducerade skador visas i figur 1. I avsaknad av skada, kan ~ 1% av den totala plasmid-DNA finns i Y-båge när celler växer snabbt i exponentiell fas. Efter bestrålning, är en övergående ökning av Y-formade molekyler observeras som blockerade replikering gafflar samlas på skadade områden. X-formade replikering intermediärer också övergående ackumuleras och kvarstår tills en tid som korrelerar med när skador repareras.
<p class="jove…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet i vårt labb stöds av KARRIÄR utmärkelse MCB0551798 från National Science Foundation och området bevilja R15GM86839 från NIGMS-NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning – A laboratory manual. , (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Génétique. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
