UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi
Summary
Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
DNA hasarı varlığı Yanlış çoğaltma ve yaygın olarak insanlarda kanser gelişimi ile doğrudan ilişkili olduğuna inanılan tüm hücre tiplerinde gözlenen hücresel düzenlenmeleri ve mutagenez çoğunluk için sorumludur. DNA hasarı, UV ışını ile indüklenen gibi ciddi doğru genomik şablonu çoğaltmak çoğaltma yeteneğini bozar. Bir dizi gen ürünleri çoğaltma şablon DNA lezyonlar karşılaştığında gerekli olduğu tespit edilmiştir. Ancak, kalan meydan çoğaltma sırasında bu proteinlerin nasıl süreci lezyonları belirlemek olmuştur<em> In vivo</em>. Escherichia coli bir model sistem olarak kullanarak, iki boyutlu agaroz-jel analizi kopyalayan plazmid ortaya çıkan yapısal ara tanımlamak için kullanılabilecek bir prosedür tarif<em> In vivo</em> UV ışınlarına bağlı DNA hasarını. Bu prosedür, UV hasarına tarafından bloke çoğaltma çatal, reca ve RecF yolağı ile ilişkili çeşitli gen ürünleri tarafından stabilize geçici bir ters tabi olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Bu teknik, bu çoğaltma ara nükleotid eksizyon onarımı ve çoğaltma devam eder lezyonların kaldırılması ile ilişkilendiren bir saatine kadar korunur olduğunu gösteriyor.
Protocol
Discussion
UV hasarına varlığı ve yokluğu vahşi tip hücreler elde edilen tipik sonuçlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Hasar yokluğunda, hücreler üstel fazda hızla büyüyor ~% 1, toplam plazmid DNA Y ark. Bloke çoğaltma çatal hasarlı siteleri biriktikçe ışınlama takiben, Y şekilli moleküllerin geçici bir artış görülmektedir. X-şeklinde çoğaltma ara lezyonlar tamir ile ilişkilendiren bir saatine kadar geçici olarak birikir ve devam.
Güney analizi yerine, çoğaltma a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuarımızda NIGMS-Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı ve ALANI hibe R15GM86839 KARİYER ödül MCB0551798 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning – A laboratory manual. , (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Génétique. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
