Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Summary

Peixe-zebra tem emergido como uma poderosa<em> In vivo</em> Plataforma para telas baseadas em fenótipo de drogas e análise química genética. Aqui, nós demonstramos um método simples e prática em larga escala de triagem de pequenas moléculas usando embriões zebrafish.

Abstract

Dado o seu tamanho pequeno embrião, o rápido desenvolvimento, a transparência, a fecundidade, e numerosas semelhanças moleculares, morfológicas e fisiológicas para os mamíferos, peixe-zebra tem emergido como uma poderosa<em> In vivo</em> Plataforma para telas baseadas em fenótipo de drogas e análise química genética. Aqui, nós demonstramos um método simples e prática em larga escala de triagem de pequenas moléculas usando embriões zebrafish.

Protocol

1) Coleta Egg Zebrafish Na tarde anterior ao dia da tela químicos, criado 10-20 tanques de criação de peixe-zebra. Encher cada tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede de pesca, a transferência de um adulto do sexo masculino e 1-2 fêmeas adultas para recipiente interno em cada tanque de criação. Separar os peixes machos e fêmeas do outro com uma divisória. Rótulo as gaiolas e colocar uma tampa em cima deles. Na manhã da tela, remover os divisores de tanques de criação…

Discussion

Ao planejar uma tela químicos baseados em zebrafish, atenção especial deve ser dada a robustez do fenótipo em questão e da taxa de fundo de fenótipo tal. Isto é particularmente importante para as telas de supressores químicos de um fenótipo induzido. Por exemplo, para um fenótipo causado por choque térmico a indução de um transgene, a condição que induz o fenótipo reproducibly deve ser precisamente traçada antes de iniciar a tela para evitar inaceitavelmente elevado as taxas de falsos positivos. Com um …

Materials

1. Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
2. Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
3. Petri dishes (10 cm).
4. Plastic tea strainer.
5. Wash bottle containg embryo water.
6. Disposable polyethylene transfer pipettes.
7. Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
8. Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
9. Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ , 0.33 mM MgSO₄ , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
11. 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12. 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
13. Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
15. Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
18. Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).