Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Summary

Zebrafish è emersa come un potente<em> In vivo</emPiattaforma> per il fenotipo a base di schermi di droga e analisi chimica genetica. Qui, abbiamo dimostrato un metodo semplice e pratico per lo screening su larga scala di piccole molecole usando embrioni di zebrafish.

Abstract

Date le loro dimensioni embrione piccolo, rapido sviluppo, la trasparenza, la fecondità, e numerose somiglianze molecolari, morfologiche e fisiologiche per i mammiferi, zebrafish è emersa come un potente<em> In vivo</emPiattaforma> per il fenotipo a base di schermi di droga e analisi chimica genetica. Qui, abbiamo dimostrato un metodo semplice e pratico per lo screening su larga scala di piccole molecole usando embrioni di zebrafish.

Protocol

1) Zebrafish Egg Collection Nel pomeriggio prima del giorno dello schermo chimica, istituito 10-20 vasche di allevamento pesce zebra. Riempire ogni serbatoio con acqua dal sistema di acquacoltura. Utilizzando una rete di pesce, il trasferimento di un maschio adulto e 1-2 femmine adulte di contenitore interno in ciascun serbatoio di allevamento. Separare i pesci di sesso maschile e femminile le une dalle altre con un divisore. Etichetta le gabbie e mettere un coperchio su di loro. La mattina dello sc…

Discussion

Quando si pianifica un pesce zebra-based schermo chimica, particolare attenzione deve essere posta la robustezza del fenotipo in esame e il tasso di sfondo di tale fenotipo. Ciò è particolarmente importante per le schermate per soppressori chimica di un fenotipo indotto. Ad esempio, per un fenotipo causato da shock termico ad induzione di un transgene, la condizione che induce il fenotipo riproducibile deve essere tracciata con precisione prima di iniziare lo schermo per evitare i tassi di falsi positivi inaccettabilm…

Materials

1. Minimum of 20 pairs of adult zebrafish of desired genotype.
2. Fish nets, Breeding tanks, with removable inner container and dividers (Aquatic Habitats).
3. Petri dishes (10 cm).
4. Plastic tea strainer.
5. Wash bottle containg embryo water.
6. Disposable polyethylene transfer pipettes.
7. Polystyrene 96-well round-bottom assay plates (Corning COSTAR; Lowell, MA).
8. Glass Pasteur pipette (Fisher Scientific).
9. Manual pipette pump, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
10. E3 embryo medium: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂ , 0.33 mM MgSO₄ , containing 0.003% PTU (phenylthio-carbamide, Sigma; St. Louis, MO). PTU can be prepared as a 10x solution by dissolving 0.3-g PTU in 1 L of E3 embryo media. Solutions containing PTU should be protected from light by covering with aluminum foil.
11. 12-channel pipettes, 2-20 μL (Eppendorf).
12. 12-channel pipettes, 3-300 μL (Eppendorf).
13. Disposable polystyrene pipette basin, 50 mL (Fisher Scientific).
14. Small molecule library of structurally diverse compounds arrayed in a 96-wll format at 10 mM stock in DMSO. Each master plate is aliquoted into 96-well polypropylene storage plates (Corning), and stored at -80°C until use.
15. Aluminum sealing tape for 96-well plates (Nunc, Rochester, NY).
16. DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
17. Basic incubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
18. Stereomicroscope with transmitted light base (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).