Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Просмотров живых культур показывают клетки через 1 час после покрытия и дифференцированных нейронов после 2 дней роста бикарбоната основе определенной среде. Нейроны являются электрически возбудимыми и формы синаптических связей.
Это видео показывает, порядок внесения первичных нейронов культур от midgastrula стадии эмбриона дрозофилы. Методы сбора эмбрионов и их dechorionation использования отбеливателя демонстрируются. Использование стеклянной пипетки придает трубке всасывания рот, мы проиллюстрируем удаление всех клетках одного из эмбрионов. Метод диспергирования клетки от каждого embyro в небольшой (5 л) каплю среды на немелованной стекло покровное демонстрируется. Вид через микроскоп на 1 час после покрытия иллюстрирует предпочтительный плотность клеток. Большинство клеток, которые выживают при выращивании в определенной среде являются нейробластов, которые делят один или несколько раз в культуре, прежде чем предоставлять neuritic процессов 12-24 часов. Вид через микроскоп иллюстрирует уровень аксонов и ветвление ожидается в здоровую культуру в 2-х дней в лабораторных условиях. Культур выращивают в простой бикарбонат основан определенной среде, в 5% CO 2 инкубаторе при 22-24 ° С. Neuritic процессов продолжать разрабатывать в течение первой недели в культуре и, когда они делают контакт с нейритов из соседних клетках они часто образуют функциональные синаптических связей. Нейроны в этих культурах выразить напряжения закрытого натрия, кальция и калия каналов и являются электрически возбудимыми. Эта культура система полезна для изучения молекулярно-генетических и экологических факторов, которые регулируют дифференциацию нейронов, возбудимость, и формирование синапса / функцию.
В культурах Drosophila приготовленные из эмбрионов midgastrula этапе нейроны возникают из нейробластов предшественников, многие из которых делят до дифференциации в пробирке. Эта система обеспечивает, таким образом уникальные возможности для исследования генетических и экологических факторов, важных в ?…
Эта работа была поддержана NIH грант NS27501 к DKOD. Дополнительная поддержка для этой работы из HHMI профессор Грант DKOD.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Drosophila melanogaster | Animal | Fruit flies | ||
Transferrin | Reagent | Sigma | T-1147 | 100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. |
Insulin | Sigma | I-6634 | 200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C. | |
Putrescine | Sigma | P-5780 | 100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C | |
Selenium | Sigma | S-5261 | 100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | 100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C | |
DDM1 | Medium | To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin | ||
Petri dishes | ||||
Cover-slips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | Low lead glass, autoclaved. | |
Paper filter | Whatman | #1 | ||
10cc syringe | Tool |
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.