1) Beredning av E. coli DH5α Cell lysat Inokulera en 2ml kultur (LB media i ett provrör) med E. coli DH5α stam direkt från en glycerol lager och inkubera vid 37 ° C och 250 rpm för 8 h. Använd autoklaveras LB media (10 g / l Bacto-trypton, 5 g / L jästextrakt, 10 g / L NaCl, pH 7,5). Inokulera 250 medier ml LB i en 1 L shaker kolven med bafflar med 2 mL kultur och inkubera över natten vid 37 ° C och 166 rpm i en inkubator med skakapparat. Inokulera fyra 5 L shaker kolvar med bafflar som båda innehåller 2,5 media L LB med 250 ml kultur (50 ml per flaska) och inkubera kulturer vid 37 ° C och 166 rpm tills en OD 600 på 0,8 uppnås. Harvest cellerna genom centrifugering vid 4 ° C, 3000x gi 20 min. Utför vidare hantering vid 0-4 ° C eller på is. Återuppslamma skördade cellen materialet i Milli-Q Water, kombinera i en centrifug hink och centrifugera i ytterligare 30 min vid 6000x g och 4 ° C. Förvara den resulterande 20 materialet g cell vid -20 ° C eller -78 ° C. Återsuspendera cellerna i 100 ml iskall cell öppning buffert (6,7 mM MES, 6,7 mm NaOAc, 6,7 mm HEPES, 1 mM EDTA, 10 mm β-merkaptoetanol, 200 mM NaCl, pH 7,5, 10% (w / v) glycerol, 0,2 mM PMSF) och Sonikera tre gånger under 1 minut i fyra 25 ml på is med hjälp av en sonifier (t.ex. SONOPULS HD 2070 från BANDELIN elektroniska GmbH & Co KG, maximal amplitud, kontinuerlig utgång). Centrifugera lysat över natten på 2370x g och 2 ° C. Koncentrera supernatanten till 14 ml genom ultrafiltrering (t.ex. med iCON koncentratorer, 7 mL/9K, från Pierce) på 2370x g och 2 ° C. Bryter trögflytande koncentrat från små molekyler som Sam eller SAH genom gelfiltrering vid 2 ° C (t.ex. Zeba AVSALTA Spin Columns, 10 ml, från Pierce, fyra kolumner, lagring buffert bort vid 1000x gi 2 minuter, fyra gånger jämvikt med 5 ml iskall cell öppning buffert och buffert bort vid 1000x gi 2 minuter, respektive 3,5 ml koncentrat tillämpas på varje kolumn, 45 min centrifugering vid 24x g, sedan två gånger 2 min vid 1000x g) Tillägg den resulterande 13 ml lysat med 13 ml iskall glycerol och Roche mini-proteashämmare tabletter cocktail, EDTA gratis. Blanda och lös upp tabletterna. Förvara lysat vid -20 ° C Bestäm den totala proteinkoncentration av Bradford-analysen (21 mg / ml i detta fall). Bradford reagens: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 i 50 ml 95% etanol, tillsätt 100 ml 85% (w / v) fosforsyra, späd till 1 liter när färgen helt har lösts upp och filtrera genom Whatman # 1 papper bara före användning. 2) Capture analys (A), konkurrens Control (C), Pulldown (PD), konkurrens Kontroll av Pulldown (CPD) och kombinerad Capture-analys plus Pulldown (A + PD) För att fånga experimenten var SAH caproKit (caprotec bioanalytics GmbH) som används, vilket inkluderar SAH-CC, fri SAH som konkurrent, streptavidin-belagd magnetiska pärlor med 1 mm diameter (Dynabeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen Dynal), 5X fånga buffert (5X CB, innehållande 100 mM HEPES, 250 mm kaliumacetat, 50 mm magnesium acetat och 50% glycerol) och 5X tvättbuffert (5X WB, innehållande 250 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 5 M NaCl, 42,5 mikroM oktyl-β-D-glukopyranosid). För flera parallella experiment är det rekommenderat att förbereda en mästare blandning av vatten, fånga buffert och E. coli lysat och att utföra reaktioner inom olika rör med en 200 mikroliter-PCR rör band (rekommenderas 0,2 ml Thermo-Strip, Thermo Scientific, AB-1114). Här finns mängder för ett reaktionsrör ges. Resultat för fem olika experiment kommer att presenteras, som fångar analys (A), konkurrens kontroll (C), pulldown (PD), konkurrens kontroll över pulldown (CPD) och kombinerad fånga analys plus pulldown (A + PD). För varje reaktion, förbereda 1,5 ml 1X WB genom att tillsätta 0,3 mL 5X WB till 1,2 ml Milli-Q Water. Förbered SAH-CC laddad streptavidin-belagd magnetiska kulor (caproBeads) i 200 mikroliter PCR-röret remsor. Därför, blanda 25 mikroliter av 100 mikroM SAH-CC med 50 mikroliter av 10 mg / ml streptavidin-belagd magnetiska kulor för varje delprov, Skaka den resulterande indragningar i rumstemperatur i 2 min för att bindningen av biotin fraktionen av SAH- CC till streptavidin på den magnetiska pärla ytan och samla pärlor med hjälp av en stark magnet (t ex i mössor av PCR-röret remsorna med caproMagTM magnetisk enhet, caprotec bioanalytics GmbH). Kasta supernatanterna, återsuspendera den resulterande caproBeads i 200 mikroliter WB, magnetiskt samla caproBeads (i mössor av PCR-röret remsor), och kassera supernating WB. Nära rören för att undvika uttorkning av pärlor. Förbered alikvoter av E. coli DH5α helacell lysat i nya PCR-rör vid 0-4 ° C med en Master Mix (se 2.2). För en reaktion, komplettera en volym på Milli-Q vatten till en slutlig reaktionsblandning volym av 100 mikroliter med 20 mikroliter 5X CB. Blanda, lägg till 0,26 mg E. coli lysat, och blanda försiktigt genom inversion. Endast för C och CPD, tillsätt 20 mikroliter 10 mM SAH konkurrent lösning och blanda försiktigt genom inversion (lägg Milli-Q vatten istället för SAH lösningen på ett, PD, och A + PD). Rita en 1 mikroliter prov från A för vidare analys (se nedan). Häng caproBeads i respektive lysat och inkubera i 3 timmar vid 4 ° C håller pärlorna i suspension genom rotation för att reversibel bindning av SAH proteiner till SAH selektivitet funktion av SAH-CC. Placera suspensioner A, C och A + PD i caproBoxTM (enheten för bestråla biokemiska prover med UV-ljus och samtidigt kyla, caprotec bioanalytics GmbH) och bestråla en total tid på 30 min i det slutna rör mellan 0-4 ° C att bilda ett kovalent Crosslink mellan reaktivitet funktion av SAH-CC till SAH proteiner. Därför, ta bort suspensioner efter bestrålning intervaller på 2,5 minuter respektive från caproBoxTM, låt svalna i isvatten för ~ 15 s (speciellt lock), blanda flera gånger av inversion, inom kort (~ 2 s) centrifug för att upphävandet återstående i lock, och sätt tillbaka in i caproBoxTM för nästa bestrålning intervall. Tillsätt 20 mikroliter 10 mM SAH lösning till A, eller 20 mikroliter Milli-Q Water till C, PD, CPD, och A + PD och inkubera suspension 10 minuter vid 4 ° C för att tränga undan, i A, SAH bindande proteiner inte tvärbunden till SAH-CC. Förvara kulorna i suspension genom rotation eller intermittent manuellt resuspension. Samla caproBeads från befrielsen, med en stark magnet (t.ex. caproMagTM), kassera supernatanterna och tvätta kulorna sex gånger – genom resuspension och insamling – med 200 mikroliter 1X WB och en gång med 200 mikroliter Milli-Q Water. Kulorna kan lagras i Milli-Q vatten i flera veckor vid 4 ° C. Alternativa protokoll för vidare bearbetning av den fångade proteiner och deras identifiering (se diskussion). Tvätta pärlor tre gånger med 200 mikroliter 60% acetonitril (ACN) och släpp den tagna proteiner från pärlor efter 10 minuter inkubation vid rumstemperatur under kraftig omskakning med 200 mikroliter 60% ACN/0.2% trifluorättiksyra (TFA) (förbereda färsk) . Använd LC-MS-grade reagenser och vatten. Magnetiskt samla pärlor, separera och indunsta supernatanten till torrhet med hjälp av en centrifugal förångare (t.ex. MIVAC DNA koncentrator från GeneVac, Inc., Storbritannien). Kasta pärlor. 3) SDS-PAGE av Fångad Proteiner För SDS-PAGE, lös upp den fångade proteiner frigörs från magnetiska kulor (avdunstat ACN / TFA-lösningar från steg 2,12) i 20 mikroliter SDS prov buffert (50 mM Tris HCl, 320 mm β-merkaptoetanol, 2,5% SDS, 0,05% Bromfenolblått , 10% glycerol, pH 6,8). Blanda 1 mikroliter urval som dras från A (se steg 2,5) med 19 mikroliter SDS prov buffert, användning 5 mikroliter av denna lösning för SDS-PAGE analys (0,25% av test). Värm prover i SDS prov buffert 10 min till 95 ° C och låt låt svalna till rumstemperatur. Analysera med SDS-PAGE (allmänna inställning: OLS ® ProPage 4-20% Tris / glycin prefabricerade geléer, OLS OmniPage mini gelelektrofores systemet, SDS löpande buffert: 25 mM Tris bas, 200 mm glycin, 0,1% SDS, pH 8,3 , körtid 90 min vid en konstant spänning på 180 V under isen kylning av SDS löpande buffert). Silver färga gelen med hjälp av en MS-kompatibel silver bets metod (t.ex. ProteoSilver Silver Stain Kit från Sigma). En representant Resultatet visas i figur 2. 4) I-gel Tryptic Digest av proteiner och Peptide Utsug från Gel Band Tvätta silver färgade gelen minst tre gånger med 100 ml Milli-Q vatten i 10 min efter det silver fläcken helhetslösning togs bort. Klipp ut gelen band (t.ex. med hjälp av en ren skalpell och överför till ett 0,5 ml Eppendorf-rör) och förvara vid -20 ° C eller direkt process. Tvätta gelen banden i 15 min respektive med 100 mikroliter vatten, 100 mikroliter 50% etanol, 100 mikroliter vatten, 100 mikroliter 50% etanol, och för 5 min med ren etanol. Upprepa tvättningen ytterligare en gång. Återfukta gelen bandet med 10 mikroliter i-gel digestion lösning (12,5 ng / mikroliter sekvensering årskurs trypsin i 50 mm ammoniumbikarbonat, förbereda genom att tillsätta 7,5 mikroliter 0,5 mikrogram / mikroliter trypsin lösning i 1 mM HCl till 292,5 mikroliter 50 mM ammoniumbikarbonat ) under 45 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och ersätt med 20 mikroliter 50 mM ammoniumbikarbonat (utan trypsin) följt av inkubering vid 37 ° C över natten under omskakning. Samla supernatanten. För peptid utvinning, inkubera gelen bandet med 20 mikroliter 5% myrsyra (FA) i 15 minuter under omskakning lägga20 mikroliter ACN och inkuberas i ytterligare 15 minuter under omskakning. Kombinera supernatanten med föregående supernatanten och upprepa peptiden extraktionsförfarande igen. Indunsta de kombinerade tre supernatanterna till torrhet, lös upp i 10 mikroliter 5% FA under omskakning och tillämpa ultraljud (ultraljudsbad, t.ex. Sonorex från Bandelin, Tyskland) och fortsätter med avsaltning (steg 5,2 och vidare). 5) Tryptic Digest av tillfångatagna Proteiner och Beredning av peptider för LC-MS/MS Lös den tagna proteiner frigörs från magnetiska kulor (avdunstat ACN / TFA-lösningar från steg 2,12) i 10 mikroliter 50 mM ammoniumbikarbonat med ett ultraljudsbad vortexa, tillsätt 1 mikroliter 0,5 mikrogram / mikroliter trypsin i 1 mM HCl och inkubera lösningen på 37 ° C över natten. AVSALTA lösningen innehåller Tryptic peptider av de tagna proteiner med hjälp av C18 material (t ex 2-10 mikroliter StageTips, 20 mikroliter spets, Proxeon Biosystems A / S, Odense, Danmark, tillverkarens förfarande: förutsättning med 10 mikroliter 50% metanol / 5 % FA, jämvikt med 10 mikroliter 5% FA, ladda med peptider tillfångatagna proteiner, tvätta med 10 mikroliter 5% FA, eluera två gånger med 10 mikroliter 50% metanol / 5% FA). Förånga desalted peptider i 50% metanol / 5% FA till torrhet, lös upp i 5,5 mikroliter 0,1% FA under omskakning och använda ultraljud (ultraljud bad) och analysera provet genom nanoLC-MS/MS. 6) NanoLC-MS/MS Analys Överför provet till exempel plåt och placera plattan i nano-flödet vätskekromatografi (nanoLC) systemet (t.ex. Easy-NLC Vätskekromatografisystem; Proxeon Biosystems A / S, Danmark). Använd 0,1% FA i vatten som rörlig fas A och 0,1% FA i ACN som rörlig fas B. Använd endast LC-MS klass lösningsmedel. Belastning 5 mikroliter av peptiden lösningen direkt på en pre-kolumn (t.ex. nanoflow Biosphere C18, 5 ìm, 120 A, 20 x 0,1 mm, NanoSeparations, Nederländerna) kopplad till en analytisk kolonn (t.ex. nanoflow Biosphere C18, 5 ìm, 120 A , 100 x 0,075 mm, NanoSeparations, Nederländerna) med 5% ACN/0.1% FA. Under LC, eluera peptider under en 80 min linjär övertoning från 5% ACN/0.1% FA till 40% ACN/0.1% FA följt av ytterligare 2 min till 100% ACN/0.1% FA och kvar på 100% ACN/0.1% FA i ytterligare 8 min med ett kontrollerat flöde på 400 Nl / min. Utför masspektrometrisk (MS) analys av elueras peptider på en hög noggrannhet state-of-the-art masspektrometer (t.ex. LTQ Orbitrap XL masspektrometer, Thermo FisherScientific, Tyskland, utrustad med en nanoelectrospray jonkälla för elektrospray jonisation (ESI), Proxeon Biosystems A / S, Danmark). Utför masspektrometrisk analysen i data-beroende läge för att automatiskt växla mellan orbitrap-MS (profil-läge) och LTQ-MS/MS (centroiden läge) förvärvet. Styr massa cykel spektrometer plikt genom att injektionen tiden Automatic Gain Control. Förvärva undersökning fullständig genomsökning MS spektra (från m / z 300 till 2000) i orbitrap med upplösning r = 60 tusen på m / z 400 (efter ackumulering till ett målvärde på 500.000 avgifter i den linjära jonfälla). Ställ in instrumentet till sekventiellt isolera de mest intensiva joner (upp till fem, beroende på signalstyrka) för fragmentering i den linjära jonfälla med kollision-induced dissociation (CID) vid ett målvärde på 10.000 avgifter. Den resulterande fragment joner registreras i LTQ. För noggrann massa mätningar i MS-läge, använd enstaka laddade polydimethylcyclosiloxane bakgrund jon (Si (CH 3) 2 O) 6 H + (m / z 445,120025) som alstras under elektrospray processen från luften låset massan i realtid interna omkalibrering. Dynamiskt utesluta mål joner redan mass-ut för CID under hela 60 s. Ställ screening laddningstillstånd och förkastande av joner för CID med lediga laddning. Ytterligare masspektrometrisk inställningarna är följande: ställ spraya spänningen till 1,6 kV, ställ temperaturen på den uppvärmda överföringen kapillär till 200 ° C, och normaliserade kollision energi är 35% för MS 2. Den minimala signal som krävs för MS 2 är 500 räknas. Applicera en aktivering q = 0,25 och en aktivering på 30 ms för MS 2 förvärv. För att rengöra LC system, en tom köra mellan två på varandra följande CCMS mätningar. 7) peptid-och proteinidentifiering via automatiserad Sequence Database Search Använd en algoritm proteinidentifiering att analysera MS / MS-data (i detta fall lagras i RAW-filer), t.ex. SEQUEST genomföras i BioworksBrowser 3.3.1 SP1 (Thermo FisherScientific, Tyskland) och X! Tandem (Global Proteome Machine Organisation, version 2007.01.01.1) genomförs i Scaffold 3 (version Scaffold_3_00_03, Proteome Software Inc., USA). Utför automatisk databassökning mot den senaste UniProtKB / Schweiz-Prot databas släpper www.expasy.org av organismen undersökta (databas som används för denna studie: Escherichia coli, stam K12, släpp 57-11). Använd följande inställningar för automatisk sökning i databaser inom SEQUEST: 5 ppm föregångare tolerans, en AMU fragment jon tolerans, och full trypsin specificitet tillåter upp till två missade klyftor. Tillåt som variabel ändringar fosforyleringen på serin, treonin och tyrosin, oxidation av methionines, deamidation på asparagin och glutamin, acetylering på lysin och serin, formylation på lysin, och metylering på arginin, lysin, serin, treonin och asparagin. Använd inte fast ändringar i databasen sökningen. Ladda SRF eller DTA och ut filer som genereras av SEQUEST till schavotten 3, som utför sannolikhetsbedömning av peptid uppdrag och identifikationer protein genom att kombinera SEQUEST och X! Tandem sökningar databas. Scaffold är användbart för att enkelt jämföra och visualisera protein listor från flera prover (i detta fall A, C, PD, CPD, och A + PD). Ställ in parametrarna i ställningen 3 programvara för att enbart beakta peptider med ≥ 95% sannolikhet som anges av peptiden Profeten algoritm (ref.13). Ställ sannolikheter proteinidentifiering för flera peptid uppdrag till ≥ 95% enligt Protein profeten algoritmen 13. För enskilda identifieringar peptid protein, godtyckligt ställa protein sannolikheten till ≥ 50% och manuellt inspektera motsvarande peptiden MS / MS spektra. Proteiner som består av liknande peptider och kunde inte differentieras baserat på MS / MS-analys enbart är grupperade efter programvaran för att fråga uppfyller principerna om sparsamhet. Den uppskattade falska upptäckten hastighet av peptid identifikationer kan bestämmas med hjälp av omvända synsätt protein databas och ska vara <1%. Representativa resultat av CCMS experiment finns i tabellerna 1, 2 och Kompletterande tabell S1 (ihåg att proteinet databasen inte up-to-date för vissa proteiner, t.ex. PrmB (alias YfcB) eller RSMH (aka MraW)), samt enligt figur 3. 8) representativa resultat Tabell 1: Protein ORF MW / kDa Beskrivning Substrat En C PD CPD A + PD DCM b1961 53,5 DNA-cytosin MTase DNA (m5C) 1 0 0 0 1 RlmI b0967 44,4 23S rRNA m5C1962 MTase rRNA (m5C) 17 0 17 0 20 RlmL b0948 78,9 23S rRNA m2G2445 MTase rRNA (m2G) 12 0 0 0 10 TrmB b2960 27,3 tRNA (guanin-N (7) -)-MTase tRNA (m7G) 11 0 0 0 13 CmoA b1870 27,8 tRNA (cmo5U34)-MTase tRNA (mcmo5U) 7 0 0 0 4 RsmG b3740 23,4 16S rRNA m7G MTase rRNA (m7G) 6 0 1 0 5 RSMH b0082 34,9 16S rRNA m4C1402 MTase rRNA (m4C) 5 0 0 0 7 RsmD b3465 21,7 16S rRNA m2G966 MTase rRNA (m2G) 2 0 0 0 2 RsmB b3289 48,3 16S rRNA m5C967 MTase rRNA (m5C) 1 0 0 0 0 MnmC b2324 74,4 Bifunktionell protein innehåller tRNA (MIM (5) S (2) U34)-MTase tRNA (mnm5s2U) 1 0 0 0 0 PrmB b2330 35,0 50S ribosomala proteinet L3 Gln150 MTase protein (GLN) 13 0 0 0 15 Cher b1884 32,8 Chemotaxis protein MTase protein (GLU) 0 0 0 0 1 CFA b1661 44,9 Cyklopropan-feta-acyl-fosfolipid-syntas småmolekylära 15 0 0 0 14 Tam b1519 29,0 Trans-aconitate 2-MTase småmolekylära 2 0 0 0 3 CysG b3368 50,0 Siroheme syntas innehåller uroporphyrinogen-III C-MTase småmolekylära 1 0 0 0 2 SMTA b0921 29,8 Protein SMTA (? En) 7 1 0 0 8 MtnN b0159 24,4 5'-Methylthioadenosine / SAH nucleosidase småmolekylära B 36 0 0 0 39 GlnA b3870 51,9 Glutaminsyntetas småmolekylära C 90 0 0 0 97 RplK b3983 14,9 50S ribosomala proteinet L11 av protein MTase PrmA d 2 0 0 0 2 en inte (helt) karakteriseras b Nej metylering men klyvning av glykosidbindning av SAH c Nej metylering men bindande för SAH i ATP-bindningsstället vilket framgår av CCMS experiment med ATP som konkurrent (data visas inte) d substrat 50S ribosomala proteinet L11 MTase PrmA, reproducerbar specifik identifiering av CCMS (data visas inte) Tabell 1: MTases och andra utvalda proteiner identifieras av CCMS experiment. De angivna siffrorna anger ovägda peptiden spektrala greve Per protein. Prover är dubbletter av dessa analyseras av SDS-PAGE/silver fläcken i figur 2. Mycket mer MTases och andra SAH bindande proteiner är identifierade i CCMS analys (A) jämfört med rullgardinsmenyn (PD) och SAH specificitet visas av den nästan totala avsaknaden av dessa proteiner i tävlingen kontroll (C). Tabell 2: En C PD CPD A + PD En 111 (64) C 65 (41) 107 (46) PD 25 (15) 23 (13) 61 (17) CPD 23 (13) 22 (12) 20 (14) 47 (14) A + PD 87 (61) 64 (41) 23 (14) 22 (12) 124 (67) Tabell 2: Totalt antal identifierade proteiner i CCMS springer och överlappning protein mellan körningar. Antalet proteiner identifieras med minst 2 peptider anges inom parentes. Den höga metodens reproducerbarhet kan härledas från hög proteinhalt överlappning (av främst ospecifika proteiner) mellan jämförbara experiment (A mot C och särskilt A mot A + PD men också PD vs CPD) särskilt med proteiner robust identifieras med minst 2 peptider. Se även figur 3 för Venn diagram och kompletterande S1 tabell finns en lista över alla identifierade proteiner. Figur 1a: Kemisk struktur trifunctional Capture Compound (CC). Selektiviteten funktion är inramat med en droppe, reaktiviteten funktion med en stjärna och sortering funktion med en halvmåne. Den kemiskt stabil S-adenosyl-L-homocystein (SAH) är kofaktor produkt av S-adenosyl-L-metionin (SAM) efter metylgrupp överföringen genom SAM-beroende MTases, som SAH fungerar som en produkt-hämmare. Figur 1b: CCMS "on-pärla "arbetsflöde. CC är bunden på magnetiska kulor av dess sortering funktion (en), är det så bildas caproBeads inkuberas med den komplexa proteinblandningens (b), där en reversibel bindning jämvikt (c) är etablerat mellan selektivitet funktion CC och de proteiner som mål. Vid UV-bestrålning (d), bildar reaktivitet funktionen en kovalent Crosslink. Efter tvättning av magnetiska kulor som bär fångade proteiner (e), klyvning av tvärbunden CC-protein komplex från magnetiska kulor (f) och Tryptic smälta (g), kan den tagna proteiner identifieras med MS-analys av Tryptic peptider. Figur 2: SDS-PAGE/silver fläck analys av fångade proteiner (efter steg f i figur 1B). Körfältet beskrivning ges på toppen av gelen (MW: molekylviktsmarkör med motsvarande molekylvikt av markören banden ges till mycket höger, L: 0,25% prov tas från E. coli DH5a helcells lysat innan du lägger till caproBeads i steg b i figur 1B, A: assay med tillsats av ett överskott av fria SAH efter UV-strålning steg d i figur 1B, C: kontroll av analysen inklusive ett överskott av fria SAH som konkurrent under steg c och d i figur 1B (väsentliga att fastställa eventuella ospecifikt fångas proteiner), PD: pulldown mening ingen UV-strålning steg d i figur 1B och inga tillägg av fria SAH, byggproduktdirektivet: kontroll av pulldown med SAH som konkurrent, A + PD: kombinerad analys plus pulldown mening inget utöver fria SAH under arbetsflödet). Proteiner identifieras med MS från utskurna protein gel band efter att i-gel Tryptic smälta ges till mycket leftt. Det är uppenbart att foto-crosslinking ökar avkastning och känsligheten i experimentet, och specificiteten kan lätt testas för i konkurrens experiment med ett överskott av fria SAH. Se tabell 1 för MTases och andra utvalda proteiner identifieras av CCMS experiment av dubbla prover av de som visas i denna figur. Figur 3: Venndiagram explaning överlappningen av identifierade proteiner i CCMS analys (A), konkurrens kontroll (C) och pulldown (PD). Vänster: Antal MTases och SAH nucleosidase, endast med hänvisning till tabell 1. Höger: Antal alla identifierade proteiner enligt Tabell 2 och kompletterande S1 tabell. Antalet proteiner identifieras med minst 2 peptider anges inom parentes.