1) Bereiding van E. coli DH5a cellysaat Inoculeren een 2 ml cultuur (LB media in een reageerbuis) met de E. coli-stam DH5a direct uit een glycerol voorraad en incubeer bij 37 ° C en 250 rpm gedurende 8 uur Gebruik geautoclaveerd LB media (10 g / l Bacto-trypton, 5 g / L gistextract, 10 g / L NaCl, pH 7,5). Inoculeren 250 ml LB media in een 1 L shaker kolf met schotten met de 2 ml cultuur en incubeer overnacht bij 37 ° C en 166 rpm in een incubator met rondschudapparaat. Inoculeer vier 5 L shaker kolven met schotten met elk 2,5 L LB media met de 250 ml cultuur (50 ml per fles) en incubeer de cultuur bij 37 ° C en 166 rpm tot een OD 600 van 0,8 is bereikt. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 4 ° C, 3000x g gedurende 20 minuten. Voer verdere behandeling bij 0-4 ° C of op ijs. Resuspendeer de oogst celmateriaal in Milli-Q water, te combineren in een centrifuge emmer en centrifuge voor een nog eens 30 min bij 6000x g en 4 ° C. Bewaar de resulterende 20 g celmateriaal bij -20 ° C of -78 ° C. Resuspendeer de cellen in 100 ml ijskoude cel opening buffer (6,7 mM MES, 6,7 mM NaOAc, 6,7 mM HEPES, 1 mM EDTA, 10 mM β-mercapto-ethanol, 200 mM NaCl, pH 7,5, 10% (w / v) glycerol, 0,2 mM PMSF) en ultrasone trillingen drie keer gedurende 1 minuut in vier 25 ml porties op het ijs met behulp van een sonifier (bijv. Sonopuls HD 2070 van Bandelin electronic GmbH & Co KG, maximale amplitude, continu vermogen). Centrifugeer het lysaat 's nachts bij 2370x g en 2 ° C. Concentreer de supernatant aan 14 ml door ultrafiltratie (bijvoorbeeld met iCON Concentrators, 7 mL/9K, van Pierce) op 2370x g en 2 ° C. Afbreken van de viskeuze concentraat van kleine moleculen, zoals SAM of SAH door gelfiltratie bij 2 ° C (bijv. Zeba ontzouten Spin kolommen, 10 ml, van Pierce, vier kolommen, opslag buffer verwijderd 1000x g gedurende 2 min; vier maal evenwicht met 5 ml ijskoude cel opening buffer en buffer verwijderd 1000x g gedurende 2 min, respectievelijk 3,5 ml concentraat toegepast op elke kolom, 45 min centrifugeren bij 24x g, dan twee keer 2 min bij 1000x g) Aanvulling op de resulterende 13 mL lysaat met 13 ml ijskoude glycerol en Roche mini proteaseremmer cocktail tabletten, EDTA vrij. Mengen en oplossen van de tabletten. Bewaar het lysaat bij -20 ° C Bepaal de totale hoeveelheid eiwit concentratie door de Bradford assay (21 mg / ml in het onderhavige geval). Bradford reagens: 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 ml 95% ethanol, voeg 100 ml 85% (w / v) fosforzuur, vul aan tot 1 L als de kleurstof volledig is opgelost, en filtreer door Whatman # 1 papier net voor gebruik. 2) Capture Assay (A), Concurrentie Control (C), Pulldown (PD), Concurrentie Controle van Pulldown (CPD), en gecombineerde Capture Assay plus Pulldown (A + PD) Voor het vastleggen experimenten werd de SAH caproKit (caprotec bioanalytics GmbH) gebruikt, die ook de SAH-CC, gratis SAH als concurrent, streptavidine-gecoate magnetische korrels met een micrometer diameter (Dynabeads MyOne Streptavidine C1, Invitrogen Dynal), 5X capture buffer (5X CB, met 100 mM HEPES, 250 mM kaliumacetaat, 50 mM magnesiumacetaat en 50% glycerol), en 5X wasbuffer (5x WB, met 250 mM Tris HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 5 M NaCl, 42,5 uM octyl-β-D-glucopyranoside). Voor de verschillende parallelle experimenten is het aanbevolen om een master mix van water voor te bereiden, vast te leggen buffer en E. coli lysaat en om reacties uit te voeren binnen de verschillende buizen van een 200 pi-PCR tube strip (aanbevolen 0,2 ml Thermo-Strip, Thermo Scientific, AB-1114). Hier worden hoeveelheden voor een reactie tube gegeven. Resultaten voor vijf verschillende experimenten zullen worden gepresenteerd, die capture assay (A), concurrentie control (C), pulldown (PD), de concurrentie controle van de pulldown (CPD), en gecombineerd capture assay plus pulldown (A + PD). Voor elke reactie, voor te bereiden 1,5 ml 1X WB door het toevoegen van 0,3 ml 5x WB tot 1,2 ml Milli-Q water. Bereid SAH-CC geladen streptavidine-gecoate magnetische korrels (caproBeads) in 200 pi PCR tube strips. Daarom is 25 pi van 100 uM SAH-CC mengen met 50 ul van 10 mg / ml streptavidine-gecoate magnetische korrels voor elk aliquot, krachtig schudden de resulterende suspensies bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten om binding van de biotine-groep van de SAH- CC aan de streptavidine op het magnetische bolletje oppervlak, en het verzamelen van de kralen met behulp van een sterke magneet (bijvoorbeeld in de doppen van de PCR-buis stroken met de caproMagTM magnetisch apparaat, caprotec bioanalytics GmbH). Gooi de supernatanten, resuspendeer de resulterende caproBeads in 200 uL WB, magnetisch verzamelen de caproBeads (in de doppen van de PCR-buis strips), en gooi de supernating WB. Dicht buizen om uitdrogen te voorkomen van de kralen. Bereid hoeveelheden van E.coli DH5a helecellysaat in de nieuwe PCR-buizen op 0-4 ° C met behulp van een master mix (zie 2.2). Voor een reactie, aan te vullen een volume van Milli-Q water voor een laatste reactie mix volume van 100 ul met 20 pi 5x CB. Mix, voeg 0,26 mg E. coli lysaat, en meng door de inversie. Alleen voor C en CPD, voeg 20 ul 10 mM SAH concurrent oplossing en meng door de inversie (add Milli-Q water in plaats van de SAH oplossing voor de A, PD, en A + PD). Teken een 1 ui monster van A voor verdere analyse (zie hieronder). Hang de caproBeads in de respectieve lysaat en incubeer gedurende 3 uur bij 4 ° C houden van de parels in suspensie door de rotatie tot omkeerbare binding van SAH bindende eiwitten aan de SAH selectiviteit functie van de SAH-CC mogelijk te maken. Plaats de schorsingen A, C en A + PD in de caproBoxTM (toestel voor het bestralen van biochemische monsters met UV-licht en tegelijkertijd koeling, caprotec bioanalytics GmbH) en bestralen voor een totale tijd van 30 min in de gesloten buizen tussen de 0-4 ° C om een covalente verknopen tussen de reactiviteit functie van de SAH-CC naar de SAH bindende eiwitten te vormen. Daarom is, verwijder dan de suspensies na bestraling met intervallen van 2,5 min, respectievelijk van de caproBoxTM, koel in ijswater voor ~ 15 s (vooral de deksels), meng een paar keer door de inversie, zeer kort (~ 2 s) centrifuge tot opschorting resterende verwijderen in de deksels, en plaats terug in de caproBoxTM voor de volgende bestraling interval. Voeg 20 ul 10 mM SAH oplossing voor een, of 20 pL Milli-Q water tot C, PD, CPD, en A + PD en incubeer de suspensie gedurende 10 min bij 4 ° C aan, verplaatsen in A, SAH bindende eiwitten niet verknoopt aan de SAH-CC. Houd de parels in suspensie door de rotatie of door intermitterende handmatige re-vering. Verzamel de caproBeads van de schorsingen met een sterke magneet (bijv. de caproMagTM), gooi de supernatanten, en was de kralen zes keer – door re-suspensie en collectie – met 200 pi 1X WB en een keer met 200 pi Milli-Q water. De kralen kunnen worden opgeslagen in Milli-Q water gedurende een aantal weken bij 4 ° C. Alternatieve protocollen bestaan voor de verdere verwerking van de gevangen eiwitten en hun identificatie (zie bespreking). Was de kralen drie keer met 200 pi 60% acetonitril (ACN) en laat de gevangen eiwitten uit de kralen door 10 min incubatie bij kamertemperatuur onder krachtig schudden met 200 pi 60% ACN/0.2% trifluorazijnzuur (TFA) (vers te bereiden) . Gebruik LC-MS-grade reagentia en water. Magnetisch verzamelen van de kralen, scheiden en verdampen het supernatant droog met behulp van een centrifugale verdamper (bijv. MiVac DNA concentrator uit GeneVac, Inc, Verenigd Koninkrijk). Gooi de kralen. 3) SDS-PAGE van Captured Eiwitten Voor de SDS-PAGE, ontbinding van de gevangen eiwitten vrij uit de magnetische korrels (verdampt ACN / TFA-oplossingen van stap 2.12) in 20 pi SDS sample buffer (50 mM Tris HCl, 320 mM β-mercapto-ethanol, 2,5% SDS, 0,05% broomfenolblauw , 10% glycerol, pH 6,8). Meng de ui een steekproef van A (zie stap 2.5) met 19 pi SDS sample buffer, het gebruik 5 pi van deze oplossing voor SDS-PAGE-analyse (0,25% van de test). Verhit de monsters in SDS sample buffer 10 min tot 95 ° C en laat laat afkoelen tot kamertemperatuur. Analyseren door SDS-PAGE (generieke setup: OLS ® ProPage 4-20% Tris / glycine pre-cast gels; OLS OmniPage mini-gel-elektroforese systeem; SDS draait buffer: 25 mM Tris base, 200 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,3 ; looptijd 90 minuten bij een constante spanning van 180 V, onder ijs koeling van de SDS lopen buffer). Zilveren vlekken op de gel met behulp van een MS-compatibele zilveren vlek methode (bijvoorbeeld ProteoSilver Silver Stain Kit van Sigma). Een vertegenwoordiger resultaat is weergegeven in figuur 2. 4) In-gel Tryptische Digest van eiwitten en peptiden Extractie van Gel Bands Was het zilver gekleurde gel minstens drie keer met 100 ml Milli-Q water gedurende 10 minuten na de zilveren vlek stop oplossing werd verwijderd. Knip de gel bands (bijvoorbeeld met een schone scalpel en overbrengen naar een 0,5 ml Eppendorf buis) en bewaar bij -20 ° C of direct te verwerken. Was de gel banden voor 15 min, respectievelijk met 100 pL water, 100 ul 50% ethanol, 100 ul water, 100 ul 50% ethanol en voor 5 min met zuivere ethanol. Herhaal deze procedure nog eens wassen. Re-hydraat de gel band met 10 pi in-gel spijsvertering oplossing (12,5 ng / ul sequencing graad trypsine in 50 mM ammoniumbicarbonaat, voor te bereiden door het toevoegen van 7,5 pi 0,5 ug / ul trypsine oplossing in 1 mM HCl tot 292,5 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat ) gedurende 45 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en te vervangen door 20 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat (zonder trypsine), gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende de nacht tijdens het schudden. Verzamel de supernatant. Voor de peptide-extractie, incubeer de gel band met 20 ui 5% mierezuur (FA) gedurende 15 minuten onder schudden, toe te voegen20 pi ACN en gedurende nog eens 15 minuten onder schudden. Combineer het supernatant met de vorige supernatant en herhaal de peptide extractieprocedure opnieuw. Damp de gecombineerde drie bovenstaande vloeistoffen tot droog, los op in 10 ui 5%, terwijl FA schudden en het toepassen van echografie (ultrageluid bad, bijvoorbeeld Sonorex uit Bandelin, Duitsland) en gaan met ontzouting (stap 5.2 en verder). 5) Tryptische Digest van Captured eiwitten en bereiden van peptiden voor LC-MS/MS Los van de gevangen eiwitten vrij uit de magnetische korrels (verdampt ACN / TFA-oplossingen van stap 2.12) in 10 pi 50 mM ammoniumbicarbonaat met behulp van een ultrasoon bad en vortexen, voeg 1 ui 0,5 ug / ul trypsine in 1 mM HCl en incubeer de oplossing bij 37 ° C gedurende de nacht. Ontzouten van de oplossing die de tryptische peptiden van de gevangen eiwitten met behulp van C18 materiaal (bijv. 20-10 il StageTips, 20 pL tip, Proxeon Biosystems A / S, Odense, Denemarken, fabrikant volgt: pre-conditie met 10 pi 50% methanol / 5 % FA, evenwicht met 10 pi 5% FA, belasting met peptiden van gevangen eiwitten, wassen met 10 pi 5% FA, elueren tweemaal met 10 pi 50% methanol / 5% FA). Damp de ontzout peptiden in 50% methanol / 5% FA tot droog, los op in 5,5 ui 0,1%, terwijl FA schudden en het toepassen van echografie (ultrageluid bad) en analyseren van het monster door nanoLC-MS/MS. 6) NanoLC-MS/MS Analyse Overdracht monster in monster bord en laat de plaat in de nano-flow vloeistofchromatografie (nanoLC) systeem (bijv. Easy-NLC vloeistofchromatografie systeem; Proxeon Biosystems A / S, Denemarken). Gebruik 0,1% FA in water als mobiele fase A en 0,1% FA in ACN als mobiele fase B. Gebruik alleen LC-MS kwaliteit oplosmiddelen. Belasting 5 pi van het peptide-oplossing direct op een pre-kolom (bijv. nanoflow Biosphere C18, 5 micrometer, 120 A, 20 x 0,1 mm, NanoSeparations, Nederland) gekoppeld aan een analytische kolom (bijv. nanoflow Biosphere C18, 5 micrometer, 120 Å , 100 x 0.075 mm; NanoSeparations, Nederland) met behulp van 5% ACN/0.1% FA. Tijdens de LC, elueren peptiden tijdens een 80 minuten lineaire gradiënt van 5% ACN/0.1% FA tot 40% ACN/0.1% FA, gevolgd door een extra 2 min tot 100% ACN/0.1% FA en de resterende 100% ACN/0.1% FA voor nog eens 8 minuten met een gecontroleerde debiet van 400 nL / min. Voer massaspectrometrie (MS) analyse van geëlueerd peptiden op een hoge nauwkeurigheid state-of-the-art massaspectrometer (bijv. LTQ Orbitrap XL massaspectrometer, Thermo FisherScientific, Duitsland, uitgerust met een nanoelectrospray ionenbron voor electrospray ionisatie (ESI); Proxeon Biosystems A / S, Denemarken). Voer de massaspectrometrische analyse in het data-afhankelijke functie voor het automatisch schakelen tussen Orbitrap-MS (profiel-modus) en LTQ-MS/MS (centroïde mode) acquisitie. De controle van de massa-spectrometer duty cycle door het instellen van de injectie tijd Automatic Gain Control. Acquire survey full-scan MS-spectra (van m / z 300 tot 2000) in de Orbitrap met de resolutie van r = 60.000 bij m / z 400 (na accumulatie tot een streefwaarde van 500.000 ladingen in de lineaire ion trap). Stel het instrument om sequentieel te isoleren van de meest intense ionen (tot vijf, afhankelijk van de intensiteit van het signaal) voor fragmentatie in de lineaire ion val met behulp van een botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) bij een streefwaarde van 10.000 kosten. Het resulterende fragment ionen worden opgenomen in de LTQ. Voor nauwkeurige massa metingen in de MS-modus, gebruikt u de enkelvoudig geladen polydimethylcyclosiloxane achtergrond ion (Si (CH 3) 2 O) 6 H + (m / z 445.120025) die tijdens de electrospray proces van omgevingslucht als het slot massa voor real-time interne herijking. Dynamisch al uit te sluiten doelwit ionen massa-geselecteerd voor CID voor de duur van 60 s. Stel laadtoestand screening en afwijzing van ionen voor de CID met een niet-toegewezen kosten. Verder massaspectrometrische instellingen zijn als volgt: stel spuiten spanning op 1,6 kV, ingestelde temperatuur van de verhitte overdracht capillair tot 200 ° C, en genormaliseerd botsingsenergie is 35% voor MS 2. De minimale signaal nodig is voor MS 2 is 500 telt. Breng een activatie q = 0,25 en een activering tijd van 30 ms voor MS twee acquisities. Voor het reinigen van het LC-systeem, voert u een lege rijden tussen twee opeenvolgende CCMS metingen. 7) peptide en proteïne identificatie via Automated Sequence Database Search Gebruik een eiwit identificatie algoritme om de MS / MS-gegevens (in dit geval opgeslagen in het raw-bestanden), bijvoorbeeld Sequest geïmplementeerd in BioworksBrowser 3.3.1 SP1 (Thermo FisherScientific, Duitsland) en X! Tandem (The Global Proteome machine-organisatie te analyseren; versie 2007.01.01.1) geïmplementeerd in de Scaffold 3 software (versie Scaffold_3_00_03, Proteome Software Inc, USA). Voer geautomatiseerde database zoeken tegen de meest recente UniProtKB / Zwitserse-Prot databank vrijkomen www.expasy.org van het organisme onderzocht (database die wordt gebruikt voor de huidige studie: Escherichia coli, stam K12, release 57-11). Gebruik de volgende instellingen voor geautomatiseerde database zoeken binnen Sequest: 5 ppm precursor tolerantie, 1 amu fragment ion tolerantie, en de volledige trypsine specificiteit waardoor maximaal twee gemiste splitsingen. Laat als variabele wijzigingen fosforylatie op serine, threonine, tyrosine en, oxidatie van methionines; deamidatie op asparaginen en glutamine; acetylering bij lysine en serine; formylering bij lysine, en methylatie in arginine, lysine, serine, threonine, en asparagine. Gebruik geen vast wijzigingen in de database zoeken. Belasting SRF of dta en uit bestanden gegenereerd door Sequest naar het schavot 3, die waarschijnlijk de beoordeling van peptide opdrachten en eiwitidentificaties door het combineren van Sequest en X! Tandem database-zoekopdrachten uitvoert. Steiger is handig voor het eenvoudig vergelijken en visualiseren eiwit lijsten van verschillende monsters (in casu A, C, PD, CPD, en A + PD). Stel de parameters in het schavot 3 software om alleen peptiden overwegen met ≥ 95% kans zoals gespecificeerd door de Peptide Profeet algoritme (ref.13). Stel eiwit identificatie van kansen voor meerdere peptide opdrachten aan ≥ 95% volgens de Protein profeet algoritme 13. Voor een peptide eiwitidentificaties, willekeurig ingesteld eiwit kans op ≥ 50% en handmatig controleren van de overeenkomstige peptide MS / MS spectra. Eiwitten die soortgelijke peptiden bevatten en niet kan worden gedifferentieerd op basis van MS / MS analyse alleen worden gegroepeerd door de software aan de principes van zuinigheid te voldoen. De geschatte valse ontdekking snelheid van peptide identificaties kan worden bepaald met behulp van de omgekeerde eiwit databank aanpak en moet <1%. Representatieve resultaten van het CCMS experimenten worden gegeven in de tabellen 1, 2, en Aanvullende Tabel S1 (let op dat het eiwit database niet up-to-date voor sommige eiwitten, bijv. PrmB (aka YfcB) of RsmH (aka MraW)), maar ook zoals in figuur 3. 8) representatieve resultaten Tabel 1: Eiwit ORF MW / kDa Beschrijving Substraat Een C PD CPD A + PD Dcm b1961 53,5 DNA-cytosine MTase DNA (m5C) 1 0 0 0 1 RlmI b0967 44,4 23S rRNA m5C1962 MTase rRNA (m5C) 17 0 17 0 20 RlmL b0948 78,9 23S rRNA m2G2445 MTase rRNA (m2G) 12 0 0 0 10 TrmB b2960 27,3 tRNA (guanine-N (7) -)-MTase tRNA (m7G) 11 0 0 0 13 CmoA b1870 27,8 tRNA (cmo5U34)-MTase tRNA (mcmo5U) 7 0 0 0 4 RsmG b3740 23,4 16S rRNA m7G MTase rRNA (m7G) 6 0 1 0 5 RsmH b0082 34,9 16S rRNA m4C1402 MTase rRNA (m4c) 5 0 0 0 7 RsmD b3465 21,7 16S rRNA m2G966 MTase rRNA (m2G) 2 0 0 0 2 RsmB b3289 48,3 16S rRNA m5C967 MTase rRNA (m5C) 1 0 0 0 0 MnmC b2324 74,4 Bifunctionele eiwit bevat tRNA (MNM (5) s (2) U34)-MTase tRNA (mnm5s2U) 1 0 0 0 0 PrmB b2330 35,0 50S ribosomaal proteïne L3 Gln150 MTase eiwit (Gln) 13 0 0 0 15 Cher b1884 32,8 Chemotaxis eiwit MTase eiwit (Glu) 0 0 0 0 1 CFA b1661 44,9 Cyclopropaan-vetzuur-acyl-fosfolipide synthase kleine molecule 15 0 0 0 14 Tam b1519 29,0 Trans-aconitinezuur 2-MTase kleine molecule 2 0 0 0 3 CysG b3368 50,0 Siroheme synthase omvat uroporphyrinogen-III C-MTase kleine molecule 1 0 0 0 2 SmtA b0921 29,8 Eiwit smtA (? A) 7 1 0 0 8 MtnN b0159 24,4 5'-Methylthioadenosine / SAH nucleosidase klein molecuul b 36 0 0 0 39 GlnA b3870 51,9 Glutamine synthetase klein molecuul c 90 0 0 0 97 RplK b3983 14,9 50S ribosomale eiwit L11 van eiwitten MTase PrmA d 2 0 0 0 2 een niet (volledig) gekenmerkt b Nee methylatie, maar de splitsing van de glycosidebinding van SAH c Geen methylatie, maar de binding van SAB in de ATP bindingsplaats zoals blijkt uit CCMS experimenten met ATP als concurrent (gegevens niet getoond) d substraat van de 50S ribosomale eiwit L11 MTase PrmA; reproduceerbaar specifieke identificatie door de CCMS (gegevens niet getoond) Tabel 1: MTases en andere geselecteerde eiwitten geïdentificeerd door CCMS experimenten. De gegeven cijfers geven de ongewogen peptide spectrale tellen per eiwit. Monsters zijn duplicaten van die geanalyseerd door SDS-PAGE/silver vlek in figuur 2. Veel meer MTases en andere SAH bindende eiwitten worden geïdentificeerd in het CCMS assay (A) in vergelijking met de pulldown (PD) en de SAH specificiteit blijkt uit de bijna volledige afwezigheid van deze eiwitten in de competitie controle (C). Tabel 2: Een C PD CPD A + PD Een 111 (64) C 65 (41) 107 (46) PD 25 (15) 23 (13) 61 (17) CPD 23 (13) 22 (12) 20 (14) 47 (14) A + PD 87 (61) 64 (41) 23 (14) 22 (12) 124 (67) Tabel 2: Totaal aantal geïdentificeerde eiwitten in de CCMS loopt en eiwit overlap tussen de pistes. Het aantal eiwitten geïdentificeerd met minstens twee peptiden worden gegeven tussen haakjes. De hoge reproduceerbaarheid van de methode kan worden afgeleid uit het hoge eiwit overlap (van voornamelijk niet-specifieke eiwitten) tussen vergelijkbare experimenten (A vs C en vooral A vs A + PD, maar ook PD vs CPD), vooral met de eiwitten robuust geïdentificeerd met minstens twee peptiden. Zie ook figuur 3 voor Venn-diagrammen en aanvullende Tabel S1 voor een lijst van alle geïdentificeerde eiwitten. Figuur 1A: Chemische structuur van de trifunctionele Capture Compound (CC). De selectiviteit functie wordt omlijst met een druppel, de reactiviteit functie met een ster, en de sortering functie met een halve maan. De chemisch stabiel S-adenosyl-L-homocysteine (SAH) is het cofactor product van S-adenosyl-L-methionine (SAM) na methylgroep overdracht door SAM-afhankelijke MTases, waarvoor SAH werkt als een product-remmer. Figuur 1b: CCMS "on-kraal "workflow. De CC is gebonden op de magnetische korrels door de sorteer-functie (a), worden de zo gevormde caproBeads geïncubeerd met het complex eiwitmengsel (b), waar een reversibele binding evenwicht (c) is tot stand gebracht tussen de selectiviteit van de functie de CC en het doel eiwitten. bij UV bestraling (d), van de reactiviteit functie vormt een covalente verknopen. Na het wassen van de magnetische korrels met het gevangen eiwitten (e), splitsing van de verknoopte CC-eiwit-complexen van de magnetische korrels (f) , en tryptische verteren (g), kan de gevangen eiwitten geïdentificeerd worden door MS analyse van de tryptische peptiden. Figuur 2: SDS-PAGE/silver vlek analyse van gevangen eiwitten (na stap f in figuur 1B). De baan omschrijving wordt gegeven op de top van de gel (MW: moleculair gewicht marker met de overeenkomstige molecuulgewichten van de marker bands gegeven aan de zeer rechts, L: 0,25% steekproef getrokken uit de E. coli DH5a hele cellysaat voor het toevoegen van de caproBeads in stap b in Figuur 1B, A: test met toevoeging van een overmaat aan vrije SAH na UV straling stap d in figuur 1B, C: controle van de assay met een overmaat aan vrije SAH als concurrent tijdens stap c en d in figuur 1B (essentieel om vast te stellen een niet-specifiek vastgelegd eiwitten), PD: pulldown betekent dat er geen UV-straling stap d in figuur 1B en geen toevoeging van de vrije SAH, CPD: de controle van pulldown gebruik van SAH als concurrent, A + PD: gecombineerd test plus pulldown betekent dat er geen aanvulling van de vrije SAH tijdens de workflow). Eiwitten geïdentificeerd door MS van de cut-out eiwitgel bands na in-gel tryptische verteren worden gegeven aan de zeer leftt. Het is duidelijk dat foto-crosslinking opbrengst en de gevoeligheid van het experiment verbetert, en de specificiteit kan gemakkelijk worden getest in competitie experimenten met een overmaat aan vrije SAH. Zie tabel 1 voor MTases en andere geselecteerde eiwitten geïdentificeerd door CCMS experimenten van duplo-monsters van die welke in de huidige figuur. Figuur 3: Venn-diagrammen explaning de overlap van de geïdentificeerde eiwitten in CCMS assay (A), concurrentie control (C), en pulldown (PD). Links: Aantal MTases en SAH nucleosidase, alleen, met verwijzing naar tabel 1. Rechts: aantal van alle geïdentificeerde eiwitten met betrekking tot tabel 2 en aanvullende Tabel S1. Het aantal eiwitten geïdentificeerd met minstens twee peptiden worden gegeven tussen haakjes.