ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات BK<em> البويضات القيطم</em> عن طريق حقن رسول الحمض النووي الريبي. يتم التحكم في حل الخلايا خلال تسجيلات المشبك التصحيح من خلال نظام الارواء.
Abstract
ويهدف البروتوكول المقدمة هنا لدراسة تفعيل تصرف كبير ، والجهد وكا 2 + تنشيط K + (BK) القنوات. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لدراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة أخرى لقنوات ايون ومستقبلات الناقل العصبي 1. وأعرب على نطاق واسع في أنسجة BK قنوات مختلفة ، وتورطت في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، بما في ذلك تنظيم تقلص العضلات الملساء ، وضبط التردد لخلايا الشعر والتنظيم الداخلي للإفراج العصبي 2-6. يتم تنشيط قنوات BK بواسطة الاستقطاب غشاء الخلايا ، والكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + 6-9. ولذلك ، تم تصميم بروتوكول للسيطرة على كل من الجهد والحل غشاء الخلايا. في هذا البروتوكول ، ويتم حقن الحمض النووي الريبي رسول قنوات BK في البويضات المورق القيطم (V – المرحلة السادسة) ، يليه 2-5 أيام من الحضانة عند 18 درجة مئوية 10-13. يتم رفعه بقع الغشاء الذي يحتوي على واحد أو عدة قنوات BK مع التكوين من الداخل إلى الخارج باستخدام تقنيات المشبك التصحيح 10-13. هو perfused الجانب الخلايا من التصحيح المطلوب مع حلول أثناء التسجيل بحيث يمكن فحص تفعيل قناة تحت ظروف مختلفة. لتلخيص ، يتم حقن مرنا من القنوات BK في البويضات المورق القيطم قناة للتعبير عن البروتينات على غشاء البويضة ، وتستخدم تقنيات المشبك التصحيح لتسجيل التيارات المتدفقة عبر قنوات تحت الجهد للرقابة والحلول داخل الخلايا.
Protocol
1. حقن مرنا في البويضات حقن 0،05-50 نانوغرام رسول الحمض النووي الريبي التي تم نسخها في البويضات في المختبر المورق القيطم (V – المرحلة السادسة) باستخدام Nanoject الثاني التلقائي نانولتر الحاقن (دروموند الشركة العلمية ، ون?…
Discussion
نظام التعبير البويضة مثالية لتوصيف الكهربية من القنوات ايون الجهد التي تعتمد على نتيجة لخلفية منخفضة نسبيا من القنوات المحلية. وعلاوة على ذلك ، لأنه هو نظام التعبير عابرة ، فإنه يوفر وسيلة فعالة لإجراء دراسة الطفرات لهذه القنوات. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن النظام …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 – R01 – HL70393 وNS060706 لJCJC هو أستاذ الهندسة الطبية الحيوية بشأن الوقف سبنسر أولين T..
Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).