הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות
Summary
יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי ביטוי<em> Xenopus ביציות</em> על ידי הזרקת RNA שליח. הפתרון תאיים במהלך הקלטות מהדק תיקון נשלטת על ידי מערכת טפטוף.
Abstract
הפרוטוקול המובא כאן נועד לבחון את הפעלת מוליכות גדול, מתח ו-Ca 2 + המופעל K + (BK) ערוצים. הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי ללמוד את מערכת היחסים מבנה פונקציה תעלות יונים אחרים קולטני הנוירוטרנסמיטר 1. ערוצי BK באים לידי ביטוי נרחב ברקמות שונות היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיים רבים, כולל ויסות התכווצות שרירים חלקים, כוונון תדר של תאים שיער הפנימי הסדרת שחרור הנוירוטרנסמיטר 2-6. ערוצי BK מופעלים על ידי שלילת קוטביות הממברנה ועל ידי תאיים Ca 2 + ו – Mg 2 + 6-9. לפיכך, הפרוטוקול נועד כדי לשלוט הן את מתח הממברנה והפתרון תאיים. בפרוטוקול זה, RNA שליח של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis (שלב ה-V-VI) ואחריו 2-5 ימי דגירה על 18 ° C 10-13. תיקוני ממברנה המכילות אחד או מספר ערוצים BK הם נכרת עם תצורה בתוך-out באמצעות מהדק תיקון טכניקות 10-13. הצד תאיים התיקון הוא perfused עם פתרונות הרצוי במהלך ההקלטה, כך הפעלת הערוץ בתנאים שונים ניתן לבדוק. לסיכום, ה-mRNA של BK ערוצי מוזרק לתוך ביציות Xenopus laevis להביע ערוץ חלבונים על קרום הביצית, מהדק טכניקות תיקון משמשים שיא זרמים הזורמים בצינורות תחת מתח מבוקר פתרונות תאיים.
Protocol
Discussion
מערכת ביטוי הביצית הוא אידיאלי עבור אפיון אלקטרו של מתח תלויי תעלות יונים בשל הרקע נמוך יחסית של ערוצי אנדוגני. יתר על כן, מכיוון שמדובר במערכת ביטוי חולף, הוא מספק שיטה יעילה של ביצוע מחקר mutagenesis הערוצים הללו. עם זאת, ראוי לציין כי מערכת ביטוי הביצית שונה מזו בתאי יונק…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01-R01 HL70393 ו-NS060706 כדי JCJC הוא פרופסור להנדסה ביו רפואית על ט ספנסר אולין הקרן.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
