أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات
Summary
ويسجل من القنوات الأيونية الحالية باستخدام تقنيات المشبك BK التصحيح. وأعرب في قنوات BK<em> البويضات القيطم</em> عن طريق حقن رسول الحمض النووي الريبي. يتم التحكم في حل الخلايا خلال تسجيلات المشبك التصحيح من خلال نظام الارواء.
Abstract
ويهدف البروتوكول المقدمة هنا لدراسة تفعيل تصرف كبير ، والجهد وكا 2 + تنشيط K + (BK) القنوات. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لدراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة أخرى لقنوات ايون ومستقبلات الناقل العصبي 1. وأعرب على نطاق واسع في أنسجة BK قنوات مختلفة ، وتورطت في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، بما في ذلك تنظيم تقلص العضلات الملساء ، وضبط التردد لخلايا الشعر والتنظيم الداخلي للإفراج العصبي 2-6. يتم تنشيط قنوات BK بواسطة الاستقطاب غشاء الخلايا ، والكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + 6-9. ولذلك ، تم تصميم بروتوكول للسيطرة على كل من الجهد والحل غشاء الخلايا. في هذا البروتوكول ، ويتم حقن الحمض النووي الريبي رسول قنوات BK في البويضات المورق القيطم (V – المرحلة السادسة) ، يليه 2-5 أيام من الحضانة عند 18 درجة مئوية 10-13. يتم رفعه بقع الغشاء الذي يحتوي على واحد أو عدة قنوات BK مع التكوين من الداخل إلى الخارج باستخدام تقنيات المشبك التصحيح 10-13. هو perfused الجانب الخلايا من التصحيح المطلوب مع حلول أثناء التسجيل بحيث يمكن فحص تفعيل قناة تحت ظروف مختلفة. لتلخيص ، يتم حقن مرنا من القنوات BK في البويضات المورق القيطم قناة للتعبير عن البروتينات على غشاء البويضة ، وتستخدم تقنيات المشبك التصحيح لتسجيل التيارات المتدفقة عبر قنوات تحت الجهد للرقابة والحلول داخل الخلايا.
Protocol
Discussion
نظام التعبير البويضة مثالية لتوصيف الكهربية من القنوات ايون الجهد التي تعتمد على نتيجة لخلفية منخفضة نسبيا من القنوات المحلية. وعلاوة على ذلك ، لأنه هو نظام التعبير عابرة ، فإنه يوفر وسيلة فعالة لإجراء دراسة الطفرات لهذه القنوات. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن النظام …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 – R01 – HL70393 وNS060706 لJCJC هو أستاذ الهندسة الطبية الحيوية بشأن الوقف سبنسر أولين T..
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
