Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen
Summary
Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt in<em> Xenopus oöcyten</em> Door het injecteren van boodschapper-RNA. De intracellulaire oplossing tijdens de patch clamp opnames wordt bestuurd door een perfusie-systeem.
Abstract
Het protocol hier gepresenteerde is ontworpen om de activering van de grote geleiding, spanning-en Ca 2 +-geactiveerde K + (BK) kanalen te bestuderen. Het protocol kan ook worden gebruikt om de structuur-functie relatie van andere ionkanalen en neurotransmitter-receptoren een studie. BK-kanalen worden op grote schaal, uitgedrukt in verschillende weefsels en zijn betrokken bij tal van fysiologische functies, inclusief de regulering van gladde spiercontractie, frequentie tuning van binnenste haarcellen en de regulatie van neurotransmitters 2-6. BK kanalen worden geactiveerd door membraan depolarisatie en door intracellulaire Ca 2 + en Mg 2 + 6-9. Daarom is het protocol ontworpen om zowel het membraan spanning en het intracellulaire oplossing te controleren. In dit protocol wordt boodschapper-RNA van de BK-kanalen geïnjecteerd in Xenopus laevis oöcyten (fase V-VI), gevolgd door 2-5 dagen incubatie bij 18 ° C 10-13. Membraan patches die een of meerdere BK kanalen bevatten, zijn uitgesneden met de 'inside-out configuratie met behulp van patch-clamp technieken 10-13. De intracellulaire kant van de pleister is geperfuseerd met gewenste oplossingen tijdens de opname, zodat het kanaal activatie onder verschillende omstandigheden kunnen worden onderzocht. Samen te vatten, is het mRNA van BK-kanalen geïnjecteerd in Xenopus laevis oöcyten op kanaal eiwitten te uiten over de eicel membraan; patch clamp technieken worden gebruikt om de stromen door de kanalen onder gecontroleerde spanning en intracellulaire oplossingen op te nemen.
Protocol
Discussion
De eicel uitdrukking systeem is ideaal voor elektrofysiologische karakterisatie van voltage-afhankelijke ionkanalen wegens het relatief lage achtergrond van endogene kanalen. Bovendien, omdat het een transiënte expressie systeem, biedt een efficiënte methode voor het uitvoeren van mutagenese studie van deze kanalen. Toch moet worden opgemerkt dat de eicel expressie systeem verschilt van die in zoogdiercellen, waardoor er verschillen kunnen zijn in de post-translationele modificatie en vereniging met verschillende sube…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen R01-R01-HL70393 en NS060706 naar JCJC is een hoogleraar Biomedische Technologie aan de Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
