이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes
Summary
BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로 표현됩니다<em> Xenopus의 oocytes</em> 메신저 RNA를 주입하여. 패치 클램프 레코딩하는 동안 세포 솔루션은 재관류 시스템에 의해 제어됩니다.
Abstract
여기에 제시 프로토콜은 대형 전도, 전압 및 칼슘 2 + – 활성 K + (BK)이 채널의 활성화를 연구하기 위해 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 이온 채널과 신경 전달 물질 수용체 1 구조 – 기능 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. BK 채널 널리 여러 조직에서 표현되고 평활근의 수축 규제, 내부 세포의 주파수 튜닝 및 신경 전달 물질 릴리스 2-6 규제 등 많은 생리 기능에 연루되어있다. BK 채널 막에 의해 탈분극 및 세포내 칼슘 2 +와 MG 2 + 6-9로 활성화됩니다. 따라서 프로토콜은 막 전압과 세포내 솔루션을 모두 제어할 수 있도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에서는 BK 채널 메신저 RNA는 18 ° C 10-13에서 부화 후 2-5 일 뒤에 Xenopus laevis의 oocytes (무대 V – VI)에 주입합니다. 하나 또는 여러 개의 BK 채널을 포함하는 막 패치는 내부 아웃 구성을 패치 클램프 기법 10-13 사용에 excised됩니다. 패치의 세포 측면은 서로 다른 조건에서 채널 정품 인증 심사 수 있도록 녹음 중 원하는 솔루션을 perfused 있습니다. 요약하면, BK 채널의 mRNA는 oocyte 막에 채널 단백질을 표현하는 Xenopus laevis의 oocytes로 주입되며 패치 클램프 기법 제어 전압과 세포내 솔루션에서 채널을 통해 흐르는 전류를 기록하는 데 사용됩니다.
Protocol
Discussion
oocyte 표현 시스템은 내생 채널 상대적으로 낮은 배경에 의한 전압 – 의존 이온 채널의 electrophysiological 특성에 이상적입니다. 또한, 그것이 일시적 표현 시스템이기 때문에, 그것은 이러한 채널의 돌연변이 유발 연구를 수행하는 효율적인 방법을 제공합니다. 그러나, 그것이 oocyte 표현 시스템은 포유 동물 세포에서 다른 것을 지적해야하므로 다른 subunits와 포스트 translational 수정 및 결사의 차이가?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강 보조금 R01 – HL70393 및 JCJC에 R01 – NS060706 국립 연구소에 의해 지원되었다 스펜서 T. 올린 엔다우먼트에 의생명 공학 교수이다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
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