Зажим Patch и перфузии Методы изучения ионных каналов, выраженные в Xenopus Ооцитов
Summary
Ионный ток BK каналы записываются с использованием методов патч зажим. BK каналов выражаются в<em> Xenopus ооцитов</em> Путем введения информационной РНК. Внутриклеточного раствора в процессе записи патча зажим контролируется перфузии системы.
Abstract
Протокол, представленный здесь, предназначен для изучения активации большого проводимость, напряжение и Са 2 +-активированной K + (BK) каналов. Протокол также может быть использован для изучения структурно-функциональных отношений для других ионных каналов и рецепторов нейромедиаторов 1. BK каналов широко выражается в различных тканях и был замешан во многих физиологических функций, в том числе регулирование гладких мышц, частота настройки внутренних волосковых клеток и регуляции нейротрансмиттеров выпуск 2-6. BK каналы активируются деполяризацию мембраны и внутриклеточного Са 2 + и Mg 2 + 6-9. Таким образом, протокол предназначен для управления и напряжение мембраны и внутриклеточные решение. В этом протоколе РНК БК каналы вводят в Xenopus laevis ооциты (этап V-VI), а затем на 2-5 дней инкубации при 18 ° С 10-13. Мембранные патчи, которые содержат одну или несколько BK каналы вырезали с наизнанку конфигурации с помощью патча зажим методы 10-13. Внутриклеточной стороне патч озарен искомые решения во время записи, так что канал активации при различных условиях могут быть рассмотрены. Подводя итог, мРНК BK каналы вводят в Xenopus laevis ооциты выразить канала белков на ооцит мембраны; методы патч зажим используется для записи ток, протекающий через каналы в контролируемых напряжением и внутриклеточных решений.
Protocol
Discussion
Система ооцитов выражение идеально подходит для электрофизиологических характеристик напряжения зависит от ионных каналов из-за относительно низкой фоне эндогенной каналов. Кроме того, так как она является переходным системы экспрессии, она обеспечивает эффективный метод проведен?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грантов R01-R01 и HL70393-NS060706 к JCJC является профессор биомедицинской инженерии на Спенсера Т. Олина фонда.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
