İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit
Summary
BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.<em> Xenopus oositleri</em> Mesajcı RNA enjekte edilerek. Yama kelepçe kayıtları sırasında hücre içi bir çözüm perfüzyon sistemi tarafından kontrol edilir.
Abstract
Burada sunulan protokol büyük iletkenlik, voltaj ve Ca 2 + ile aktive olan K + (BK) kanalları aktivasyon çalışma için tasarlanmıştır. Protokol, aynı zamanda, diğer iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörlerinin 1 için yapı-işlev ilişkisi çalışma için kullanılan olabilir. BK kanalları farklı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve düz kas kasılması düzenlenmesi, iç saç hücrelerinin frekans ayarı ve nörotransmitter sürüm 2-6 düzenlenmesi de dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik fonksiyonları, suçlanmıştır . BK kanalları membran depolarizasyon ve hücre içi Ca 2 + ve Mg 2 + 6-9 tarafından aktive edilir. Bu nedenle, protokol, membran voltaj ve hücre içi bir çözüm kontrol etmek üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, BK kanalları mesajcı RNA 2-5 gün inkübasyon 18 ° C 10-13 takip Xenopus laevis oosit (Evre V-VI) enjekte edilir. Tek veya birden fazla BK kanalları içeren Membran yamalar yama klemp teknikleri 10-13, iç-dış yapılandırma ile eksize. Yama intraselüler tarafı, farklı koşullar altında kanal aktivasyon incelenir, böylece kayıt sırasında istenen çözümleri ile perfüze. Özetlemek gerekirse, BK kanalları mRNA oosit zarı kanal proteinleri ifade Xenopus laevis oosit içine enjekte edilir; yama klemp teknikleri, kontrollü gerilim ve hücre içi çözümleri altında kanallar aracılığıyla akıntılar kaydetmek için kullanılır .
Protocol
Discussion
Oosit ifade sistemin endojen kanalları nispeten düşük arka nedeniyle voltaj bağımlı iyon kanallarının elektrofizyolojik karakterizasyonu için idealdir. Ayrıca, geçici bir ifade sistem olduğundan, bu kanalların mutagenez çalışma yerine etkili bir yöntem sağlar. Ancak, oosit ifade sistemi memeli hücrelerinde farklı olduğunu belirtmek gerekir, böylece farklı alt birimden post-translasyonel modifikasyonu ve dernek farklılıklar olabilir. Ayrıca, lipid konsantrasyonu kanalın fonksiyonel özellikler…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağlık hibe, R01-HL70393 ve R01-NS060706 JCJC için Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen Biyomedikal Mühendisliği profesörü Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
References
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
