Tillämpning av en NMDA-receptorn Konduktans av dopaminerg Rat mitthjärnan Nervceller med det dynamiska Clamp Teknik

Summary

I denna video visar vi hur man tillämpar en konduktans i en dopaminerga neuron registreras i hela cellen konfiguration i skivor råtta hjärnan. Denna teknik kallas den dynamiska klämman.

Abstract

Neuroforskare studera hjärnans funktion genom att undersöka hur nervceller i hjärnan kommunicerar. Många utredare titta på förändringar i den elektriska aktiviteten i en eller flera nervceller som svar på ett experimentellt kontrollerade ingång. Den elektriska aktiviteten i nervceller kan spelas in i isolerade hjärnan skivor med hjälp av tekniker patch clamp med glas mikropipetter. Traditionellt kan praktiker härma neuronala ingång genom direkt injicering av ström genom pipetten, elektrisk stimulering av de andra cellerna eller återstående axonal anslutningar i segmentet, eller farmakologisk manipulation av receptorer som finns på neuronala membran av det inspelade cellen.

Likström injektionen fördelar som passerar en förutbestämd vågform med hög temporal precision på platsen för inspelningen (vanligtvis soma). Däremot ändras inte motståndet av neuronala membran som ingen jonkanaler fysiskt öppnas. Aktuell injektion använder oftast rektangulär pulser och därför inte modell kinetiken av jonkanaler. Slutligen kan nuvarande injektion inte efterlikna kemiska förändringar i cellen som sker med öppnandet av jonkanaler.

Receptorer kan vara fysiskt aktiveras av elektrisk eller farmakologisk stimulering. Försöksledaren har goda tidsmässiga precision aktivering av receptorn med elektrisk stimulering av segmentet. Det finns dock begränsad rumslig precision på aktivering av receptorn och den exakta innebörden av vad som aktiveras vid stimulering är okänd. Det senare problemet kan delvis lindras genom specifika farmakologiska agenter. Tyvärr är den tid under aktivering av farmakologiska agenter vanligtvis långsam och den rumsliga precision ingångar på inspelade cellen är okänd.

Den dynamiska clamp tekniken tillåter en försöksledaren att ändra den aktuella gick direkt in i cellen bygger på feedback i realtid av membranet potentialen i cellen (Robinson och Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. För granskning, se Prinz et al. 2004). Detta möjliggör en försöksledaren att efterlikna de elektriska förändringar som sker på platsen för inspelningen som svar på aktivering av en receptor. Ändringar i realtid i tillämpad aktuella styrs av en matematisk ekvation genomförs i hårdvara.

Vi har nyligen använt den dynamiska klämman tekniken för att undersöka generationen av skurar av aktionspotential genom phasic aktivering av NMDA-receptorer i dopaminerga nervceller i substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010.). I denna video visar vi de förfaranden som behövs för att tillämpa en NMDA-receptorn konduktans i en dopaminerga neuron.

Protocol

1. Slice Förberedelser Skär hjärnan skivor med hjälp av en vibrerande mikrotomen. Vi förberedde 240 ìm horisontella mitthjärnan skivor ur en isofluran-anethetized Sprague-Dawley råtta (Charles River Laboratories) med en vibrerande mikrotom (microM HM 650V) i enlighet med University of Texas i San Antonio Institutional Animal Care och användning kommittén. Förvara skivorna i en inkubation kammare tills du är redo att spela in. Vi använder en inkubationstid behållare uppvärmd till 32 ° C och fylld med konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF, i mm): 126 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 2 CaCl 2, 10 dextros, 25 NaHCO 3, 1,3 askorbinsyra, 2,4 natrium pyruvat och 0,05 glutation. 2. Elektrofysiologiska inspelning Överför slice till intracellulära inspelning rigg som en konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) vid 35 ° C är perfusion. Vi använder samma aCSF som i 1,2 förutom att 2mm MgCl 2 används för var och glutation utelämnats. För horisontellt beredd skivor, HALVERA vi vanligtvis bit längs mittlinjen. Visualisera målet neuron. Vi visualiseras enskilda substantia nigra dopaminerga nervceller med en lutning kontrast imaging system. Dra en elektrod med en elektronisk elektrod avdragare. Vi drar elektroder med en spets motstånd 4-10 Mohm med hjälp av en P97 Mikropipett avdragare (Sutter Instrument Company). Fyll en elektrod med önskad intern lösning. Vi använder en lösning innehållande (i mm): 138 K-glukonat, 10 HEPES, 2 MgCl 2, 0,2 EGTA, 0,0001 CaCl 2, 4 Na-ATP, 0,4 Na-GTP. Den interna lösningen var anpassad till ett pH på 7,3 med 1M KOH och en osmolaritet 270-275 mOsms. Gör en gigaohm tätningen på önskat neuron. Ruptur tätningen genom avsugning. Detta utgör en hel cell inspelning. En Multiclamp 700B förstärkare användes i vår konfiguration. Förstärkaren ska sedan placeras i "I = 0 'strömtång läge. 3. Konduktans Ansökan med Dynamic Clamp RTXI (www.rtxi.org) utfördes på den dynamiska klämman dator. En anpassad skriftligt modell som innehåller en NMDA-receptorn laddades in i minnet. Den ström som skall injiceras in i cellen i realtid beräknas genom följande ekvation: Jag NMDA =-g NMDA * [1 / (1 ​​+ ([mg] / 3,57) * e (-V m * 0,062))] * (V m – E NMDA) där g NMDA är det önskade konduktansen (i NS; som standard inställd på 0 ns), [mg] är magnesium koncentrationen (satt till 1,5 mm i vårt exempel nedan) är E NMDA återföring potential för NMDA-receptorn (satt till 0 mV), och V M är membranpotential i cellen mätt från förstärkaren (i millivolt). Utgången från den dynamiska klämman datorn var ansluten till Command ingången på förstärkaren via en analog-till-digital-omvandlaren. Förstärkaren placerades i "IC" strömtång läge. Ange ditt önskade NMDA-receptorn konduktansen i RTXI (t.ex. 40nS). Du bör se en phasic explosion av aktionspotentialer. Alternativt kan en konduktans ges till RTXI via en analog utgång (Figur 1A, 'g (t)). En lämplig skalfaktor måste användas inom RTXI för att konvertera signalen från volt till Siemens. 4. Representativa resultat En framgångsrik modell för tillämpning av en konduktans med det dynamiska klämman visas i Figur 1A. Med denna inställning, gjorde vi en hel cell somatiska inspelning från en dopaminerga neuron i substantia nigra pars compacta. Dopaminerga celler brand vanligtvis spontant till låga priser med en pacemaker-liknande mönster. Ett utbrott av aktionspotentialer kan framkallas genom phasic tillämpning av en NMDA-receptorn konduktans med dynamiska klämma (Figur 1B). Figur 1: Tillämpning av en NMDA-receptorn konduktans med det dynamiska klämman tekniken. A. maskinvaruinstallation illustrerar sambanden mellan de intracellulära inspelning riggen och dynamiska klämma dator. B. En explosion av aktionspotentialer framkallas genom tillämpning av en 40nS NMDA-receptorn konduktans i en hel cell inspelning från en substantia nigra pars compacta dopaminerga neuron.

Discussion

Den dynamiska clamp tekniken visat här förbättrar den traditionella tekniken för likström injektion genom att låta försöksledaren att härma den elektriska effekten av en aktivering av en receptor. I den här filmen har vi visat att man kan lägga till effekterna av aktivering av en NMDA-receptorn till spontan aktivitet i dopaminerga neuron, dvs en explosion av aktionspotentialer frammanade.

Tack vare flexibiliteten i hårdvara / mjukvara genomförande, kan en mängd olika tillägg användas. Tecknet av den injicerade strömmen kan kopplas om från negativt till positivt, vilket motsvarar ett scenario där effekterna av aktiverade receptorn tas bort från en neuron. Modell nervceller, representerad i form en serie av differentialekvationer, kan också vara numeriskt lösa och låta försöksledaren att undersöka små nätverk.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
K-gluconate anhydrous	Reagent	Sigma-Aldrich
HEPES	Reagent	Fisher Scientific
CaCl2 X 2H2O	Reagent	Fisher Scientific
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Reagent	EGTA; Sigma-Aldrich
MgATP	Reagent	MP Biomedicals
NaGTP	Reagent	MP Biomedicals
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Reagent	Sigma-Aldrich
KCl	Reagent	Fisher Scientific
NaH2PO4, Anhydrous	Reagent	Fisher Scientific
Glucose	Reagent	Acros Organics
NaCl	Reagent	Fisher Scientific
CholCl	Reagent	Sigma-Aldrich
Sodium Pyruvate	Reagent	Fisher Scientific
Ascorbic Acid	Reagent	Acros Organics
Glutathione	Reagent	Sigma-Aldrich
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective)	Microscope	Olympus
2 A/D converters	Equipment	e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A
Multiclamp 700B with CV-7B headstage	Equipment	Molecular Devices
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller	Equipment	Sutter Instrument Company
Microfil syringe needles	Equipment	World Precision Instruments
Micromanipulator	Equipment	Siskiyou, Inc.
Monitor	Equipment	Triview