1. Fånga Bin från bikupan En dag innan försöket startar, mellan 2 och 4 pm, är bin lämnar bikupan fast. För att göra det ett UV-ljus-permeabla plexiglas pyramid (höjd = 30 cm, Apex 3,5 x 3, 5 cm, botten 18 x 18 cm), vilket är förslutbar vid spetsen och basen, hålls på en 20 – 30 cm avstånd framför bikupa entré med basen öppna och spetsen stängda så att bin lämnar bikupan in i botten av pyramiden. Basen är då stängd och fångade bin förs in i labbet för vidare hantering. 2. Överföra Bin från pyramiden Into glasflaskor I labbet är pyramiden placeras på sin bas. Väggarna av pyramiden är mörklagt (t.ex. med en handduk) men spetsen är inte täckas. På grund av deras positiva phototaxis kommer bina lämna pyramiden genom spetsen när de öppnas. En efter en, är bina flyttas från pyramiden i glasflaskor genom att hålla flaskorna över den öppna spetsen. En injektionsflaska används per bi. Därför är toppen stängd när ett bi kommer in i flaskan. 3. Utnyttja Bin i rör Bin är immobiliserade genom att kyla dem i glasflaskor på is 2,5-3,5 min. Det är lämpligt att titta på biet och ta bort den från isen så fort det är stilla. En enda immobiliserade bi tas tillvara i ett litet plaströr med tejp, så att det kan röra sin snabel sig fritt, men inte huvudet, bröstkorgen eller ben. Det är viktigt att halsen inte är komprimerad. Varje bee fast i ett plaströr sätts i en numrerad borrhål på ett galler för bättre hantering och identifiering. Efter det har tagits bort för konditionering eller minnet hämtning röret är alltid tillbaka till exakt samma borrhål. 4. Utfodring Bin På den första kvällen (4-6 pm), efter att ha fångats, är bina matas till mättnadskänsla med sackaros lösning (0,88 M, vitt raffinerat hushåll socker upplöst i kranvatten). Att mata ett bi, är dess PER framkallas genom att röra sina antenner med sackaroslösning och djuret är tillåtet att konsumera en droppe (4 mikroliter) av sackaros lösning. Bina matas en efter en tills de inte längre visar en snabb och pålitlig PER när deras antenner är vidröras med sackaroslösning. Vid varje efterföljande kväll (4-6 pm) av experimentet bina matas efter varandra fyra gånger med en droppe sackaroslösning (4 mikroliter, 0,88 M, vitt raffinerat socker löst i kranvatten). Det är viktigt att sackaroslösning inte smetat på biets antenner eller snabel under matning och att rören inte är förorenade med sackaroslösning. Bin ska inte matas på eller nära konditionering webbplats för att utesluta möjligheten att knyta utbildningen sammanhang med sackaros stimulans. 5. Hålla utnyttjas Bin Övernattning Bina hålls över natten i en plast skål i rumstemperatur. Kranvatten fylls i skålen (ca 0,5-1 cm hög). Rack med den utnyttjas bin placeras i skålen ovanför vattenlinjen med hjälp av ELISA-plattorna som plattform. Slutligen är skålen täckt med papp. 6. Olfactory Conditioning På den första morgonen (10 am) av experimentet luktsinnet konditioneringen utförs. Den betingade stimulus (CS) är en lukt, är obetingat stimulus (US) sackaroslösning. 4 mikroliter av lukt (t ex kryddnejlika olja) är pipetteras på ett runt filtrerpapper (1,3 cm i diameter) som sedan sätts in i en 20 ml spruta. Lukten är pipetteras under en huva och filter tips används för att förhindra kontaminering av pipetten. Racket med utnyttjas bin placeras nära conditioning platsen 30 min före konditionering inleds, men på avstånd till den plats framför en avgasröret, där enstaka bin är villkorade. Konditionering består av tre Lottning för lukt (den betingade stimulus, CS) och sackaros lösning (obetingat stimulus, USA, 1,25 m) med en internationell rättegång intervallet (ITI) på 10 min. En akustisk signal levereras till försöksledaren via en ljudspelare gör den exakta tidpunkten för stimulans debut, stimulans offset, stimulans längd och placering. Ett förvärv rättegången börjar med en 10 sek placering av djur framför ett avgassystem. Strax före slutet av 10 sek sprutan innehåller den lukt är placerad 3 cm framför biets riktade till biets antenner. Därefter är den lukt som presenteras i 5 sekunder, genom att trycka 20 ml luft genom sprutan. Efter de första 3 sek distala flageller båda antenner är vidröras med en sackaroslösning-fuktade tandpetare och djur får slicka moistend tandpetare i 4 sek. 13 sek efter CS stimulering ändarna, bin tas ur utbildningen sammanhang och sätts tillbaka i racket. Sammanlagt en utbildning rättegången varar 28 sek. Det är viktigt att varken biets antenner eller snabel är täckta med sackaros efter konditionering. Därför måste det säkerställas att tandpetare bara fuktas med sackaroslösning och att inga droppar av sackaroslösning form på tandpetare. Efter konditionering av rack placeras tillbaka i skålen. Djurens beteende under experimentet, dvs förekomsten av PER under placeringen och CS och US presentation, övervakas och noteras av försöksledaren. 7. Minne Lagring Retention tester kan utföras när som helst intervall (min till dagar). Hyllan med bin är placerad nära den konditionering platsen 30 min före minnestest startar. Ett minne Provet består av 5 sek CS presentation utan USA: s presentation. Testet börjar med en 10 sek placering av djuret framför avgasröret. Därefter är den lukt som presenteras i 5 sek enligt ovan. Den djurets beteende, det vill säga förekomsten av PER under placeringen och CS presentationen är antecknade under experimentet. I slutet av experimentet snabel extention svar igen framkallas genom att trycka på antenner med sackaros lösning för att säkerställa att djuret fortfarande möjlighet att utvidga sin snabel. 8. Systemisk Injection Den tidpunkt på systemisk injektion beror på experimentell design. Ett litet hål görs i cuticula den bakre delen av scutum bredvid scutal spricka ovanför flygningen muskeln 17 med hjälp av en disponibel injektionsnål (21 G). Använda ett glas kapillärrör är en mikroliter lösning injiceras genom hålet i cuticula in flygningen muskeln. Utbildade praktiker kan injicera ett bi var 30 sekund, vilket möjliggör en exakt tidpunkt för injektion och konditionering. 9. Utfodring Bin Under experimentet På kvällen (4-6 pm) efter konditionering, är bina matas efter varandra fyra gånger med en droppe sackaroslösning (4 mikroliter, 0,88 M, vitt raffinerat socker upplöst i kranvatten). Det är viktigt att sackaroslösning inte smetat på biets antenner eller snabel under matning och att rören inte är förorenade med sackaroslösning. Bin ska inte matas på eller nära konditionering webbplats för att utesluta möjligheten att knyta utbildningen sammanhang med sackaros stimulans. 10. Datainsamling och dataanalys Förekomst av snabel förlängningen svar under försöket övervakas. Ett bi görs positivt om det utvidgar sin snabel mellan uppkomsten av CS och presentationen av den amerikanska (under utbildning) eller under CS presentationen (under testfasen), passerar en virtuell linje mellan den öppna mandibles. För att ingå i analysen djur måste uppfylla två kriterier: De måste överleva hela försöket och de måste visa det obetingade snabel förlängningen svar (PER) till sackaroslösning i slutet av experimentet. Andelen av bin som visar PER vid förvärv och tester vätskeretention är plottas för varje CS presentation. 11. Representativa resultat: Två experiment presenteras här. I det första experimentet vi tittar på effekterna av systemisk injektion av fosfatbuffrad-saltlösning (PBS, i mm: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 Na 2 HPO 4, 1,8 KH 2 PO 4, pH 7, 2) om inlärning och långtidsminne formation. Tre grupper av bin tränades med tre CS-amerikanska ihopkopplingar med en inter-rättegång intervall om 10 min: en icke-behandlade gruppen, en grupp som injicerades med 1 mikroliter PBS 30 min före träning, och en bluff-injicerade gruppen behandlade samma sätt som PBS-injicerade gruppen men utan injicera PBS. 24 h efter träning minne testades med en CS presentation i alla tre grupperna. Andelen djur som visar betingad respons under konditioneringen ökar betydligt över de tre utbildnings studier (figur 1, ANOVA för upprepade mätningar för faktorn tid F 2378 = 340.456, p <0,05). Ingen skillnad i PER kunde observeras mellan de tre grupperna under konditionering (för upprepad mätning för faktorn grupper F2, 189 = 1299, p> 0,05 ANOVA). Detta gäller för en 24 h retention test (F2, 187 = 0752, p> 0,05) när man jämför icke-behandlade djur med PBS-injicerade och simulerad injektion-injiceras djur. I det andra experimentet vi visar hämning av minne retention tre och fyra dagar efter träning då proteinsyntesen hämmare anisomycin (10 mm) systemiskt injicerades 30 minuter efter tre CS-USA pairings. Jämförelse av en anisomycin-injicerade koncern med ett PBS-injicerade grupp visar en signifikant skillnad mellan grupperna under djurhållningsperioden test (Fig.2, ANOVA för upprepade mätningar för faktorn gruppen F1, 94 = 8,86, p <0,05). En stor skillnad kan observeras vid minnestest på dag 3 och dag 4. Detta liknar resultaten från Wüstenberg et al. 18, som också betingade bin med tre CS-USA parningar, om än med ett annat protokoll. Figur 1. Cuticula lesion eller injektion av PBS ändrar inte förvärv och minne lagring. Djuren var tränade med tre CS-USA ihopkopplingar (förvärv). Efter 24 timmar var minne testades (Memory Retention). Trettio minuter innan träning, var ett hål i cuticula av två grupper (lesion, PBS) och en av dessa grupper var injicerades med en mikroliter PBS (PBS). En tredje grupp som var kvar intakt (ingen behandling). Presenteras är andelen djur för varje grupp svarar på lukt presentation med en PER. En ANOVA avslöjar inte några signifikanta skillnader mellan grupperna i förvärvet fas (F2, 189 = 1,299, p> 0,05) eller i minnet retention (F2, 187 = 0,752, p> 0,05). Figur 2. Injektion av anisomycin 40 min efter den sista CS-US para minskar minne lagring tre dagar och fyra dagar efter träning. Tränades med tre CS-USA ihopkopplingar (förvärv) och injiceras med 1 mikroliter 10 mM anisomycin (Aniso) eller 1 mikroliter PBS Djur 1 h efter den första utbildningen rättegången. Minnet testades (Memory Retention) 24 h, 48 h, 72 h och 96 h senare. Presenteras är andelen djur per grupp svara på lukt presentation med en PER. Injektion av anisomycin leder till en betydande minskning av minne retention 72 h och 96 h efter träning (F1, 94 = 8,86, p <0,05) vilket framgår av en ANOVA.