Eiwitkristallisatie voor X-ray kristallografie
Summary
De 3-D structuur van een molecuul zorgt voor een uniek inzicht in hoe het molecuul functies. De belangrijkste methode voor de bepaling van de structuur bijna-atomaire resolutie is X-ray kristallografie. Hier tonen we de huidige methoden voor het verkrijgen van drie-dimensionale kristallen van een bepaalde macromolecuul die geschikt zijn voor de structuur bepaling door X-ray kristallografie.
Abstract
Met behulp van de driedimensionale structuur van biologische macromoleculen af te leiden hoe ze werken is een van de meest belangrijke gebieden van de moderne biologie. De beschikbaarheid van atomaire resolutie structuren zorgt voor een diepe en unieke kennis van proteïne functie, en helpt bij het ontrafelen van de interne werking van de levende cel. Tot op heden 86% van de Protein Data Bank (rcsb-PDB) inzendingen zijn macromoleculaire structuren die werden bepaald met behulp van X-ray kristallografie.
Voor het verkrijgen van kristallen die geschikt zijn voor kristallografische studies, het macromolecuul (bijv. eiwitten, nucleïnezuur, eiwit-eiwit complex of eiwit-nucleïnezuur complex) moet worden gezuiverd tot de homogeniteit, of zo dicht mogelijk bij de homogeniteit. De homogeniteit van het preparaat is een belangrijke factor bij het verkrijgen van kristallen die breken op een hoge resolutie (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Kristallisatie vereist waardoor het macromolecuul naar oververzadiging. Het monster dient derhalve te worden geconcentreerd om de hoogst mogelijke concentratie, zonder dat aggregatie of precipitatie van het macromolecuul (meestal 2-50 mg / ml). De invoering van het monster tot neerslagmiddel kan bevorderen de nucleatie van eiwitkristallen in de oplossing, wat kan leiden tot grote drie-dimensionale kristallen groeien van de oplossing. Er zijn twee belangrijke technieken om kristallen te verkrijgen: dampdiffusie en batch-kristallisatie. In dampdiffusie, een druppel die een mengsel van neerslag en eiwit-oplossingen is verzegeld in een kamer met pure neerslagmiddel. Waterdamp diffundeert vervolgens uit van de daling tot aan de osmolariteit van de druppel en de neerslag zijn gelijk (Figuur 1A). De uitdroging van de daling veroorzaakt een langzame concentratie van zowel eiwit en neerslagmiddelen totdat evenwicht is bereikt, idealiter in het kristalnucleatie zone van het fasediagram. De batch methode berust op het brengen van het eiwit direct in de nucleatie-zone door het mengen van eiwit met de juiste hoeveelheid neerslag (Figuur 1B). Deze methode wordt meestal uitgevoerd onder een paraffine / minerale olie mengsel aan de diffusie van water te voorkomen uit de druppel.
Hier zullen we laten twee soorten experimentele setup voor dampdiffusie, opknoping te laten vallen en zitten druppel, naast de batch kristallisatie onder olie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we en demonstreren het algemeen de huidige protocollen voor proteïne kristallisatie. Omdat het een multi-step procedure er zijn maar weinig overwegingen moet men zich bewust zijn van. Bij het werken met zeer kleine hoeveelheden (0,5-2 pi), drogen van de daling als gevolg van verdamping is een grote zorg. Daarom is het raadzaam om te werken in een goed gecontroleerde omgeving (met een lage lucht-flow, hoge luchtvochtigheid en strakke temperatuur controle) en een techniek die minimaliseert bloo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Burroughs Wellcome Investigator Award voor YM en door een Brown-Coxe Postdoctoral Fellowship van de Yale University tot MD.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
References
- Bergfors, T. M. . Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. . Crystallization of biological macromolecules. , (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
