विकास और वयस्क स्टेज में स्थिर माध्यमिक मेटाबोलिक फ्लक्स के समस्थानिक रूपरेखा Caenorhabditis एलिगेंस</em
Summary
मध्यस्थ चयापचय प्रवाह की गैस क्रोमैटोग्राफी जन spectrometric विश्लेषण से स्थिर समस्थानिक रूपरेखा निमेटोड में वर्णित है,<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em>. तरीके कार्बन डाइऑक्साइड, कार्बनिक अम्ल, और एमिनो एसिड आइसोटोप जोखिम अगर प्लेटों पर विकास के दौरान या तरल संस्कृति में वयस्कता के दौरान या तो निम्नलिखित में समस्थानिक संवर्धन का आकलन करने के लिए विस्तृत रहे हैं.
Abstract
स्थिर समस्थानिक रूपरेखा लंबे समय आनुवंशिक परिवर्तन और / या सेलुलर और स्तनधारी मॉडल में pharmacologic उपचार के चयापचय परिणामों के प्रति संवेदनशील जांच की अनुमति दी है. यहाँ, हम विस्तृत निमेटोड, Caenorhabditis एलिगेंस में मध्यस्थ चयापचय और चयापचय प्रवाह स्थिर समस्थानिक रूपरेखा प्रदर्शन विधियों का वर्णन. तरीके स्थिर आइसोटोप या तो प्रारंभिक विकास से निमेटोड विकास मीडिया अगर या युवा वयस्कों के रूप में प्लेटें शुरुआत पर उजागर करते हुए विभिन्न pharmacologic उपचार के लिए संपर्क में पशुओं में पूरे कृमि मुक्त अमीनो एसिड, कार्बन डाइऑक्साइड लेबल, लेबल कार्बनिक अम्ल, और लेबल एमिनो एसिड की रूपरेखा के लिए में वर्णित हैं तरल संस्कृति में. मुफ्त एमिनो एसिड पूरे कीड़ा 4% perchloric एसिड में निकाले aliquots में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. वैश्विक 13 सी ग्लूकोज या 1,6 लेबल – 13 सी 2 शर्करा स्थिर समस्थानिक अग्रदूत लेबल जिसका कार्बन कार्बन डाइऑक्साइड में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (वायुमंडलीय और भंग दोनों) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से प्रवाह के संकेत चयापचयों द्वारा पता लगाया है के रूप में उपयोग किया जाता है पाइरूवेट चयापचय, और tricarboxylic एसिड चक्र. प्रतिनिधि परिणाम जंगली प्रकार नेमाटोड में आइसोटोप जोखिम समय के प्रभाव, विभिन्न जीवाणु समाशोधन प्रोटोकॉल है, और वैकल्पिक कीड़ा व्यवधान तरीकों का प्रदर्शन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में mitochondrial जटिल III उत्परिवर्ती कीड़े में समस्थानिक निगमन के रिश्तेदार हद तक (आईएसपी 1 (qm150 शामिल हैं) ) जंगली प्रकार के कीड़े के लिए सापेक्ष. रहने वाले नेमाटोड में स्थिर समस्थानिक प्रोफाइलिंग की आवेदन पूरे जानवर स्तर वास्तविक समय चयापचय परिवर्तन है कि व्यक्तिगत आनुवंशिक विकारों और / या pharmacologic चिकित्सा की वजह से कर रहे हैं पर जांच करने के लिए एक उपन्यास क्षमता प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
मास स्पेक्ट्रोमेट्री लागू करने के लिए मध्यस्थ चयापचयों में समस्थानिक बहुतायत को मापने के महत्वपूर्ण जैव रासायनिक परिवर्तन 5 का एक शानदार विस्तृत चित्र देता है. यहाँ, हम इस बेहद संवेदनशील और विशिष्ट पद्धति का शोषण करने के लिए आनुवंशिक रूप से बहुमुखी मॉडल जानवर, सी. में मध्यस्थ चयापचय प्रवाह का आकलन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है एलिगेंस. दरअसल, स्थिर आइसोटोप के साथ रहने वाले जानवरों को खिला लेबल चयापचय व्यापारियों (जैसे 13 सी के रूप में ग्लूकोज) मध्यस्थ चयापचय मार्ग प्रवाह में उपन्यास अंतर्दृष्टि परमिट जब बहाव चयापचयों में समस्थानिक संवर्धन को मापने. हम विश्वसनीय पद्धति विकसित की है ग्लाइकोलाइसिस, पाइरूवेट चयापचय, और tricarboxylic एसिड चक्र के माध्यम से प्रवाह की मजबूत विश्लेषण प्राप्त करने के लिए. यह दोनों जल्दी लार्वा विकास चरणों से स्थिर आइसोटोप खिलाया जानवरों में या बाद mitotic वयस्क अवधि में शुरुआत हासिल किया जा सकता है. विभिन्न प्रजातियों में metabolite समस्थानिक संवर्धन उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा पूरे कृमि मुक्त एमिनो एसिड की रूपरेखा के साथ संयोजन के रूप में अध्ययन किया जा सकता है है, के रूप में पहले 4 वर्णित है, मुक्त कीड़ा alanine, aspartate, ग्लूटामेट, और glutamine की विभिन्न प्रजातियों में निरपेक्ष समस्थानिक संवर्धन निर्धारित है. दरअसल, समस्थानिक संवर्धन के अनुरूप पैटर्न जब 1,000 से 2,000 युवा वयस्क तुल्यकालिक कीड़े की aliquots में एमिनो एसिड और कार्बनिक अम्ल analytes को मापने के लिए प्राप्त कर रहे हैं. इस तरह की पद्धति संवेदनशीलता परमाणु जीन आधारित mitochondrial उत्परिवर्ती जंगली प्रकार के कीड़े सापेक्ष उपभेदों में असामान्य मध्यस्थ प्रवाह भेदभाव कर सकते हैं.
इस तकनीक की प्रासंगिकता विशिष्ट जैव रासायनिक रास्ते में प्रवाह परिवर्तन चयापचय की आम सहज त्रुटियों जांच करने के लिए महत्व रखता है. विशेष रूप से, स्थिर आइसोटोप के साथ लेबल ग्लूकोज का उपयोग mitochondrial रोग के लिए प्रासंगिकता के केंद्रीय चयापचय मार्ग के माध्यम से कार्बन प्रवाह बताते हैं. दरअसल, हमारे आंकड़े बताते हैं ऐसी पद्धति के आवेदन संवेदनशीलता परमाणु जीन के आधार पर mitochondrial जटिल क्ष्क्ष्क्ष् सबयूनिट उत्परिवर्ती (आईएसपी-1 (qm150)) तनाव जंगली प्रकार के कीड़े सापेक्ष में असामान्य मध्यस्थ प्रवाह भेदभाव कर सकते हैं.
यह महत्वपूर्ण है कि पहचान के बाद से समस्थानिक जोखिम कई दिनों के लिए एक की अवधि में पूरा हो गया है, समस्थानिक संवर्धन मात्रा निर्धारित समय का एक निर्धारित अवधि में एक "स्थिर राज्य" संवर्धन बजाय मात्रात्मक प्रवाह मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है सेल आधारित मॉडल के रूप में निर्धारित किया जा सकता है घंटे मिनट की अवधि के लिए आइसोटोप को उजागर. निमेटोड विकास के पाठ्यक्रम पर मार्ग प्रवाह पूछताछ के एक अन्य संभावित सीमा लार्वा विकास की लंबाई है कि विशेष रूप से उत्परिवर्ती उपभेदों में होने भिन्न करने के लिए संबंधित है. उदाहरण के लिए, कई गंभीर mitochondrial म्यूटेशनों तिहाई (L3) लार्वा चरण 6 में गिरफ्तारी का कारण जाना जाता है . इस प्रकार, केवल जानवरों है कि वयस्कता के लिए जीवित है आइसोटोप निगमन के विश्लेषण पूरे उत्परिवर्ती की आबादी का प्रतिनिधि नहीं हो सकता. हालांकि, इस पद्धति मध्यस्थ चयापचयों में एक विशिष्ट लार्वा चरण (जैसे L2 के रूप में) के बजाय इंतज़ार कर रहे पशुओं के लिए वयस्क अवस्था तक पहुंचने के लिए समस्थानिक निगमन का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसी प्रकार, जानवरों है कि वैकल्पिक लार्वा dauer के रूप में की संभावना से जाना जाता है चरण में प्रवेश काफी बदल दिया है (संभावना कम) चयापचय प्रवाह जानवर जो चार लार्वा चरणों के माध्यम से सीधे आगे बढ़ना करने के लिए सापेक्ष. भविष्य के अध्ययन में यह भी सीधे dauer अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के मंच पशुओं में समस्थानिक निगमन का आकलन किया जा सकता है. एक निश्चित समय अवधि (यहाँ 24 से 48 घंटे) की शुरुआत एक बार जानवरों युवा वयस्क चरण में पहुंच के लिए स्थिर आइसोटोप के लिए पशुओं उजागर (के रूप में प्रोटोकॉल बी में विस्तृत) चर विकास अवधि के प्रभाव को हटा. जबकि 13 सी ग्लूकोज केवल ग्लाइकोलाइसिस, पाइरूवेट चयापचय और tricarboxylic एसिड चक्र प्रवाह पूछताछ, अन्य समस्थानिक tracers संभावित नेमाटोड में रुचि के अन्य रास्ते के माध्यम से जैव रासायनिक मार्ग प्रवाह पूछताछ करने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, 15 एन ग्लाइसिन नेमाटोड में एमिनो एसिड कारोबार का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.
इस दृष्टिकोण का एक अन्य संभावित सीमा metabolite का पता लगाने की संवेदनशीलता का स्तर है. हमारा अनुभव से पता चलता है 500 युवा वयस्क नेमाटोड के एक न्यूनतम करने के लिए सफलतापूर्वक HPLC और जीसी / एमएस यहाँ नियोजित तरीके से समस्थानिक समावेश यों के लिए आवश्यक हैं. जैसे अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) अधिक से अधिक संवेदनशीलता, के साथ उपकरणों का प्रयोग करने के लिए, जानवरों की संख्या के अध्ययन और कटौती की अनुमति है, हालांकि हम आशा करते है इस एकल कीड़े से metabolite प्रजातियों में चयापचयों और समस्थानिक निगमन के विश्वसनीय quantitation की अनुमति की संभावना नहीं है हो सकता है. हम 1,000 पशुओं के प्रति प्रयोग कीड़ा आबादी है, जो हम प्रत्येक तनाव में मज़बूती से कम बहुतायत चयापचयों का पता लगाने पाया का अध्ययन किया. हालांकि, GABA के रूप में कुछ चयापचयों,, केवल मज़बूती नेमाटोड के बहुत बड़े आबादी में कर सकते हैं मात्रा निर्धारित के आदेश पर हो1×10 6 4 जानवरों.
संक्षेप में, स्थिर आइसोटोप रूपरेखा एक गैर इनवेसिव और सुरक्षित (गैर रेडियोधर्मी) दृष्टिकोण है कि लंबे समय के लिए चयापचय की सहज त्रुटियों का अध्ययन उपयोग किया गया है प्रदान करता है. इस पद्धति के सी. के लिए आवेदन एलिगेंस उपन्यास vivo में, वास्तविक समय, चयापचय परिवर्तन है कि पूरे पशु स्तर पर होते हैं, जो व्यक्तिगत आनुवंशिक विकारों और / या pharmacologic एजेंट जोखिम से परिणाम हो सकता है में जांच की क्षमता प्रदान करता है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (K08-DK073545 और NICHD प्रायोजित बौद्धिक और विकासात्मक विकलांग रिसर्च सेंटर नई अन्वेषक पुरस्कार), फिलाडेल्फिया फाउंडेशन, और पेंसिल्वेनिया McCabe पुरस्कार के विश्वविद्यालय (MJF), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से त्रिस्टान के द्वारा वित्त पोषित किया गया था मुलेन फंड (MJF और मेरे). सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S. basal | 1 – page 59 | Protocols A and B | ||
| Cholesterol | Sigma | C-8503 | Protocol B | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocols A and C | ||
| K12 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | Protocol B | ||
| NGM agar | Research Products INT | N81800-1000.0 | Protocols A, B, and C | |
| 13C glucose (universally labeled) | Cambridge Isotope labs | CLM-1396 | Protocol A and C | |
| 13C glucose (1,6 labeled) | Cambridge Isotope labs | CLM-2717 | Protocol B | |
| 60% Perchloric acid (PCA) | Fisher | MK2766500 | Protocols A and B | |
| ε-aminocaproic acid (Internal Standard) | Sigma | A-2504 | Protocols A and B | |
| MTBSTFA | Regis | 270243 | Protocol E | |
| Acetonitrile | Regis | 270010 | Protocol E | |
| AG 1-X8, 100-200, Chloride form resin | BIO-RAD | 140-1441 | Protocols A and B (organic acid extraction) | |
| AG 50W-X8, 100-200, Hydrogen form resin | BIO-RAD | 142-1441 | Protocols A and B (amino acid extraction) | |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Protocol C | |
| NaOH | Sigma | S8045 | Protocol C | |
| 3N HCl | Sigma | 320331 | Protocol D | |
| 1N HCl | Sigma | 320331 | Protocol A | |
| 0.1 N HCl | Sigma | 320331 | Protocol D | |
| 4N NH4OH | Sigma | 30501 | Protocol D | |
| 4N KOH | Sigma | 484016 | Protocols A and B | |
| Deionized water | Milli Q Biocel | ZMQA60F01 | Protocol D | |
| Helium | Airgas | 24001364 | Protocol C2 | |
| SMZ-800 Zoom Stereo-Microscope | NIKON | NI MNA41000 | Protocols A, B, and C | |
| pH meter | Fisher | S68167 | Protocols A and B | |
| Table top centrifuge – 5804R | Eppendorf | 05-400-93 | Protocols A and B | |
| Incubated platform shaker | New Brunswick | M1324-0004 | Protocol B | |
| Mini LabRoller Rotator | Labnet | H-5500 | Protocols A and B | |
| Pestles | Kontes | K749520-0090 | Protocols A and B | |
| Drill | Kontes | K749540-0000 | Protocols A and B | |
| 1 L glass beaker | Fisher | 02-539P | ||
| 1 L Erlenmeyer Flasks | VWR | 89000-368 | ||
| 25 mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89000-356 | Protocol B | |
| 7ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR | VT6431 | Protocols A, B, and C1,C2 | |
| 10 ml round-bottom glass tubes + rubber stopper | VWR | VT6430 | Protocol C2 | |
| Blue top tubes | Labco | 438B | ||
| 50 ml conical plastic tubes | Falcon | 14-959-49A | All protocols | |
| 1.5 ml microfuge tubes | Fisher | 02-681-320 | Protocols A and B | |
| Syringes (1 mL, 10 mL, 20 mL) | BD Medical | 301025, 301029, 301031 | Protocols C1 and C2 | |
| 25 gauge needles | Fisher | 22-253-131 | Protocols C1 and C2 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIO-RAD | 731-1550 | Protocol D | |
| Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | Protocol D | |
| 60mm Petri dishes | VWR | 25373-085 | Protocol C | |
| Glass chamber (cut bottom of 1 L flask) fitted with grease-sealed 3-way stopcock | Custom Made in Glass Shop | Protocol C | ||
| Optically transparent glass plate | Custom Made in Glass Shop | Protocol C | ||
| Reacti-Vap III Evaporator | Thermo Scientific | 18826 | Protocol D | |
| Cotton | VWR | 14224-516 | Protocol D | |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | Protocol C1 | |
| Aluminum Foil | Fisher | 01-213-18 | Protocol B | |
| Timer | ISC Bioexpress | T-2504-5 | Protocol C | |
| Gas-Ratio Mass Spectrometer | Thermophinigan | Protocol D | ||
| GC-MS | HP | 5980/5971 | Protocol D | |
| GC-MS | Agilent | 6980N/5973N | Protocol D | |
| HPLC | Varian | 9010 | Protocol D |
References
- Hope, I. A. . C. elegans: A practical approach. , (1999).
- Dingley, S. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).
- Jones, B. N., Gilligan, J. P. o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids. Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).
- Falk, M. J. Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans. Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).
- Yudkoff, M. Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes. Molecular genetics and metabolism. 100, 37-41 (2010).
- Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span. J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).
