Summary

Органотипической культуре Кусочек GFP-экспрессирующих эмбрионов мыши для реального времени изображений периферической нервной вырост

Published: March 29, 2011
doi:

Summary

Мы представляем способ получения органотипической ломтиками середине беременности эмбрионов мыши для выращивания и замедленная съемка периферического отросток нерва.

Abstract

Для многих целей, культивирование естественных мыши бывший эмбрионов в качестве органотипической ломтиками желательно. Например, мы используем линию трансгенных мышей (tauGFP), в котором расширенная версия зеленого флуоресцентного белка (EGFP) исключительно экспрессируется во всех нейронов развивающихся центральной и периферической нервной системы 1, что позволяет возможность как фильм иннервации передних конечностей и манипулировать этим процессом с фармакологическими и генетическими методами 2. Наиболее критичным параметром в успешном выращивании таких культур срез метод, посредством которого ломтиками готовы. После обширного тестирования различных методов, мы обнаружили, что vibratome является наилучшим устройством для среза эмбриона, что они обычно приводят к культуре, которая демонстрирует жизнеспособность в течение нескольких дней, и, самое главное, развивается в возрасте конкретным образом. Для середине беременности эмбрионы, это включает в себя нормальным следствием спинальных нервов из спинного мозга и спинной ганглий корня до своих целей на периферии и правильного определения костной и мышечной ткани.

В этой работе мы представляем метод обработки целых зародышей эмбриональных день (E) E10 в E12 на 300 – 400 мкм ломтиками для выращивания в стандартной тканевой культуры инкубатор, который может быть изучен на срок до двух дней после среза подготовки. Решающее значение для успеха такого подхода является использование vibratome резать каждый агарозном встраиваемый эмбриона. Это сопровождается выращивания ломтиками на Millicell культуры мембраны вставки помещается на небольшой объем среды, в результате чего техника культуре интерфейс. Один помете в среднем по 7 эмбрионов обычно производит не менее 14 ломтиков (2-3 ломтика передних конечностей региону в эмбрион), который немного отличается из-за возраста эмбрионов, а также толщина ломтиков. Около 80% культурных ломтиками показать нерва результат, который можно измерить througout 2 периода культивирования. Представитель результаты, используя линию tauGFP мыши продемонстрировали.

Protocol

Часть 1: Подготовка для нарезки и культивирования. Подготовка 10-см пластин культуре ткани с нарезки среды (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,5% глюкозы, 1 мМ глутамина, 2,5 мМ HEPES, рН 7,3) и 3-х см Millicell-CM 0,4-мкм культуры мембраны вставками и держать в инкубаторе при температур…

Discussion

В обширной сравнения методов для подготовки эмбриональных культур кусочек середине беременности эмбрионов мыши (E10 – E12), мы заметили, что vibratome производит без сомнения, наиболее надежные результаты в отношении как общей жизнеспособности культур и воспроизводимость шаблоны нерва резул…

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность первоисточник для идеей является выполнять срез культуры от эмбрионов мыши 5. Мы хотели бы выразить признательность Йоахим Кирш за щедрую поддержку научных и Анна Деген за работу в качестве наших мальчиком на побегушках во время съемок. Эта работа финансировалась Немецкого исследовательского фонда (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) и Гейдельбергском университете (Совершенство кластер сотовой сети).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
HBSS 10x   GIBCO 14180  
Dissection tools   FST various  
L.M.P. agarose   Invitrogen 15517-022  
Whatmann paper   Whatman Int. 3030917  
Shortened firepolished pipettes        
DMEM   GIBCO 41966  
FBS   GIBCO 10270-106  
Pen Strep   GIBCO 15140  
L-glutamine 100x   GIBCO 25030  
Vibratome   Microm International GmbH HM 650 V  
Fluorescent microscope   Olympus BX61WI  
analySIS   Soft Imaging System    
Millicell-CM inserts   Millipore PICMORG 50  
10 cm culture plates   Greiner Bio-One 633171  
LOCTITE 406   Henkel 142580  
Razor blades   Thermo Fisher none  
Dissecting microscope   Nikon SMZ800  
HEPES   Roth 9105.2  
Glucose   Sigma G7021  
x4 objective   Olympus PL series  
x10 objective   Olympus UPLFL –PH series  
Filter   Olympus U-MNIBA2  
CCD camera   Soft Imaging System SIS F-View II  
Equipment for heated chamber   Leica CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171  

References

  1. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
  2. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
  3. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
  4. Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
  5. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).

Play Video

Citer Cet Article
Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (49), e2309, doi:10.3791/2309 (2011).

View Video