Оптимизированная стратегия Трансфекция для выражения и Электрофизиологические Запись рекомбинантных напряжением ионные каналы в НЕК-293T Клетки
Summary
Надежный метод высокоэффективной<em> В пробирке</em> Выражения и последующей записи электрофизиологических рекомбинантных напряжения закрытого ионных каналов в культуре клеток человеческого эмбриона почки (НЕК-293T).
Abstract
В выражении пробирке и электрофизиологические записи рекомбинантных напряжения закрытого ионных каналов в культуре клеток человеческого эмбриона почки (НЕК-293T) является повсеместной стратегии исследований. НЕК-293T клетки должны быть покрыты на стеклянные покровные при достаточно низкой плотности, так что они не находятся в контакте друг с другом, с тем чтобы позволить электрофизиологические записи не смешивая эффекты из-за контакта с соседними клетками. Трансфицированных каналы также должны выразить с высокой эффективностью в плазме мембраны для цельноклеточной патч зажим записи обнаруживаемых токах выше уровня шума. Гетерологическая ионные каналы часто требует длительного периода инкубации при температуре 28 ° C после трансфекции с целью достижения адекватного выражения мембраны, но Есть увеличения потерь клеточной адгезии и покровное мембраны стабильность при этой температуре. Чтобы обойти эту проблему, мы разработали оптимизированные стратегии для трансфекции и пластины НЕК-293T клеток. Этот метод требует, чтобы клетки трансфицированных быть на достаточно высоком слияния, и инкубировали при 28 ° С в течение различных периодов инкубации после трансфекции, чтобы обеспечить адекватное выражение белка ионного канала. Трансфицированных Затем клетки высевали на покровные стекла и инкубировали при 37 ° С в течение нескольких часов, что позволяет жесткой привязанности ячейки покровные и мембранных restabilization. Клетки могут быть записаны вскоре после металлизации, или может быть передано до 28 ° C для дальнейшей инкубации. Мы считаем, что начальная инкубации при температуре 28 ° C, после трансфекции, но до обшивки, имеет ключевое значение для эффективной экспрессии гетерологичных ионные каналы, которые обычно не экспрессируют также на плазматической мембране. Положительно трансфекции, культивируемых клетках определяются совместно выразили EGFP или EGFP выразил от bicistronic вектор (например, pIRES2-EGFP), содержащий рекомбинантный ионного канала кДНК чуть выше по течению от внутренних рибосомы сайт въезд и EGFP кодирующей последовательности. Всего-клеточные патч зажим записи требует специального оборудования, а также разработке полированных электродов записи и Г-образные электроды почву из боросиликатного стекла. Доставка лекарств для изучения фармакологии ионных каналов может быть достигнуто непосредственно micropipetting наркотиков в записи блюдо, или с помощью microperfusion или самотеком системы, которые производят непрерывный потоки наркотиков решение по записал клеток.
Protocol
Discussion
Возможность записи цельноклеточная токов использованием описанных протоколов и решений показывает, что трансфекция прошла успешно и желаемое напряжения закрытого ионных каналов или комплексы ионного канала присутствуют в значительных количествах в клеточной мембране. Если кле?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Discovery Операционная к JDS от естествознания и техники исследовательского совета (NSERC) Канады, NSERC Александр Грэхем Белл Канада Высшее стипендии (докторской) (А. Senatore) и сердца и инсульта фонда, грант -В-Aid Н. А. # 6284.
Materials
| Material | Company | Catalogue Number | Comment |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 – 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Zeiss Canada | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Microelectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , (2003).
- Peng, S. -. Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
