L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Il peut être difficile. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler l'albumen et de déterminer la méthylation par séquençage au bisulfite.
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Article de méthode
Détermination de méthylation de l'ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme
Dans cet article
Résumé
Résumé
Arabidopsis thaliana est un organisme excellent modèle pour étudier les mécanismes épigénétiques. Une des raisons est le mutant nul de perte de fonction de l'ADN méthyltransférases est viable, offrant ainsi un système à étudier comment la perte de méthylation de l'ADN dans un génome influe sur la croissance et le développement. Impression se réfère à l'expression différentielle des allèles maternels et paternels et joue un rôle important dans le développement de la reproduction dans les deux mammifères et les plantes. Méthylation de l'ADN est essentielle pour déterminer si les allèles maternels ou paternels d'un gène est exprimé ou imprimé au silence. Dans les plantes à fleurs, il ya un événement double fécondation de la reproduction: un spermatozoïde fertilise l'ovule pour former l'embryon et un spermatozoïde fusionne avec la seconde cellule centrale pour donner naissance à l'albumen. Endosperme est le tissu où se produit l'empreinte dans les plantes. MEDEA, un domaine SET gènes du groupe Polycomb et FWA, un facteur de transcription régulant la floraison, sont les deux premiers gènes soumis à empreinte montré dans l'endosperme et de leur expression est contrôlée par méthylation de l'ADN et la déméthylation de plantes. Afin de déterminer le statut de l'empreinte d'un gène et le modèle de méthylation dans l'albumen, nous devons être en mesure d'isoler l'albumen premier. Depuis semence est petite chez Arabidopsis, il reste difficile d'isoler l'albumen Arabidopsis et examiner sa méthylation. Dans ce protocole vidéo, nous présentons la façon de mener un croisement génétique, afin d'isoler albumen de graines, et de déterminer le statut de méthylation par séquençage au bisulfite.
Protocole
I. croisement génétique
1. Amputer le parent femelle
Afin de distinguer les allèles maternels et paternels en utilisant le polymorphisme de séquence d'ADN, deux écotypes différents, par exemple-Britannique-0 (Col-0) et Ler, seront choisis en tant que parents féminin et masculin. Les plantes doivent être jeune et saine. On peut affaiblir le parent femelle en utilisant un microscope à dissection, grossissant visière, ou de l'œil nu. Localisez étape-12 fleurs (Smyth et al., 1990) et enlever les fleurs ou siliques ci-dessus et en dessous d'eux par clipsage de la base du pédoncule avec les ciseaux. Stériliser u....
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Discussion
Il est relativement facile de séparer embryon à partir de l'endosperme et tégument, mais il est fastidieux de séparer l'endosperme du tégument, en particulier pour les semences à un stade précoce ou à mi-torpilles de l'embryogenèse. Depuis tégument ne contribue qu'à une très petite quantité de tissu, pour certains gènes, par exemple, la MEA et FWA, nous n'avons pas de séparer l'endosperme du tégument. Cela signifie que nous pouvons isoler les ARN à partir d'un mélange de tis.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs remercient Mme Jennifer M. Lommel et Tara N. Rognan pour l'entretien des plantes d'Arabidopsis. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de Saint Louis University et National Institutes of Health subventions 1R15GM086846-01 et 3R15GM086846-01S1 à W. Xiao.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
Fournitures
- Microscope à dissection
- Ciseaux
- Pince pointe fine
- Tag bijoux
- Enjeux des végétaux
- String ou les attaches
- 4 "X 2" X 8 sacs en polyéthylène "
- 3 "X 1" X 1,0 mm Lames de microscope
- Azote liquide
- Conteneurs d'azote liquide
- Bloc de chaleur
- Tubes PCR
- Thermocycleur
- Microtubes à centrifuger
- Microcentrifugeuse
- Installation électrophorèse sur gel
- Arabidopsis thaliana-0-Britannique Plantes
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plantes
Réactifs
- L'éthanol à 70%
- L'éthanol à 95%
- L'éthanol à 100%
- 0,3 M de sorbitol et 5 mM MES pH 5,7
- Bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB)
- L'éthanol à 100%
- Cholorform
- Les enzymes de restriction
- 3 M NaOH
- 6,3 M de NaOH
- 6,24 M d'urée / 4 de bisulfite de sodium M
- Distillée stérile H 2 O
- 10 mM d'hydroquinone
- Assistant DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH 4 OAc
- 20 pg / uL ARNt
- Tampon TE
- Le kit de clonage TOPO TA (Invitrogen)
Références
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E.
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Réimpressions et autorisations
