קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם
Summary
החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים מוטבעים<em> ארבידופסיס</em> יכול להיות קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד את האנדוספרם ולקבוע מתילציה של רצפי bisulfite.
Abstract
Thaliana ארבידופסיס הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מנגנוני epigenetic. אחת הסיבות היא מוטציה הפסד-of-null פונקציה של methyltransferases DNA היא בת קיימא, ובכך לספק מערכת ללמוד איך הפסד של מתילציה DNA בגנום משפיע על הגדילה וההתפתחות. החתמה מתייחס הביטוי ההפרש של אללים אימהי ואבהי ובעל תפקיד חשוב בהתפתחות רבייה הן יונקים וצמחים. מתילציה DNA הוא קריטי לקביעת אם אללים אימהי או אבהי של הגן המוטבע מבוטא או מושתק. בשנת צמחים פורחים, יש אירוע הפריה כפולה רפרודוקציה: תא הזרע מפרה את הביצית ליצירת העובר ואת הנתיכים הזרע השני עם תא מרכזי להצמיח האנדוספרם. האנדוספרם היא הרקמה בה החתמה מתרחשת בצמחים. MEDEA, תחום SET גן Polycomb הקבוצה, FWA, גורם שעתוק ויסות פריחה, הם הראשונים שני גנים הראו להיות טבועה האנדוספרם והביטוי שלהם נשלטת על ידי מתילציה של דנ"א demethylation צמחים. על מנת לקבוע את מעמדם החתמה של גן דפוס המתילציה של האנדוספרם, אנחנו צריכים להיות מסוגלים לבודד את האנדוספרם הראשון. מאז הוא זרע זעיר ארבידופסיס, הוא נותר מאתגר לבודד את האנדוספרם ארבידופסיס ולבחון מתילציה שלה. בפרוטוקול זה וידאו, אנו מדווחים איך לנהל את צלב גנטית, לבודד רקמת האנדוספרם מזרעים, כדי לקבוע את מצב המתילציה על ידי רצף bisulfite.
Protocol
Discussion
קל יחסית להפריד העובר מן האנדוספרם ואת המעיל זרע, אבל זה משעמם להפריד האנדוספרם מן המעיל זרע, במיוחד עבור זרע בשלב מוקדם או אמצע לטרפד של העובר. מאז מעיל הזרע רק תורם כמות קטנה מאוד של רקמה, עבור גנים מסוימים, למשל, MEA ו FWA, אין לנו להפריד את האנדוספרם מן המעיל ז?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לגב 'ג'ניפר מ Lommel וטרה נ Rognan לצורך תחזוקה של צמחי ארבידופסיס. עבודה זו נתמכה על ידי סטארט כספים אוניברסיטת סנט לואיס ו – National Institutes of Health מענקים 1R15GM086846-01 ו-01S1 3R15GM086846 אל שיאו וו.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
References
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
