Определение ДНК Метилирование запечатлены в генах Arabidopsis Эндосперм
Summary
Импринтинг это явление в растительном и млекопитающих воспроизводства. Метилирование ДНК играет важную роль в механизмах импринтинга. Изоляция эндосперма и определения статуса метилирования генов в запечатлены<em> Arabidopsis</em> Может быть затруднено. В этом протоколе, мы описываем, как изолировать эндосперма и определять метилирование по бисульфит секвенирования.
Abstract
Arabidopsis thaliana является отличным организма модель для изучения эпигенетических механизмов. Одной из причин является потерей функции нулевой мутанта ДНК метилтрансферазы является жизнеспособным, обеспечивая тем самым система изучить, как потерю метилирования ДНК в геноме влияет на рост и развитие. Импринтинг означает дифференциальное выражение материнских и отцовских аллелей и играет важную роль в воспроизводстве развития как млекопитающих и растений. Метилирования ДНК имеет решающее значение для определения того, материнской или отцовской аллелей запечатлены ген экспрессируется или замолчать. В цветущих растений, есть двойное событие оплодотворение в воспроизводстве: один сперматозоид оплодотворяет яйцеклетку для формирования эмбриона и второго предохранители сперматозоидов с центральной ячейки вызвать эндосперма. Эндосперм ткани, где происходит печать в растениях. Медея, SET домена Polycomb группы генов, а FWA, транскрипционный фактор регулирующих цветение, это первые два гена, показано, что запечатлелось в эндосперма и их выражения контролируется метилирования ДНК и деметилирования растений. Для того чтобы определить статус импринтинга генов и метилирования в эндосперм, мы должны быть в состоянии изолировать эндосперма в первую очередь. Так как семена в крошечных Arabidopsis, она остается сложной, чтобы изолировать Arabidopsis эндосперма и изучить его метилирования. В этом видео-протокол, мы сообщаем о том, как проводить генетические крест, чтобы изолировать эндосперма ткани из семян, и для определения статуса метилирования путем секвенирования бисульфит.
Protocol
Discussion
Это сравнительно легко отделить зародыш от эндосперма и кожуры, но это утомительно отдельных эндоспермом от кожуры, особенно для семян в начале или в середине торпедо стадии эмбриогенеза. Так как семенная оболочка только способствует очень небольшое количество ткани, для некоторых ге…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность г-жа Дженнифер М. Ломмеля и Тары Н. Rognan для поддержания Arabidopsis растений. Эта работа была поддержана запуска средства из Сент-Луиса университета и Национального института здоровья гранты 1R15GM086846-01 и 3R15GM086846-01S1 к В. Сяо.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
References
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
