Fastställande av DNA-metylering av Präglade Gener i Arabidopsis Frövitan

Summary

Imprinting är ett fenomen i anläggningar och däggdjur reproduktion. DNA-metylering spelar en viktig roll för mekanismer för prägling. Isolera frövita och bestämma metylering status präglade gener i<em> Arabidopsis</em> Kan vara svårt. I detta protokoll beskriver vi hur du kan isolera frövita och bestämma metylering av bisulfite sekvensering.

Abstract

Arabidopsis thaliana är en utmärkt modell organism för att studera epigenetiska mekanismer. En av anledningarna är förlusten-of-funktion null mutant av DNA-metyltransferaser är livskraftig, vilket ger ett system för att studera hur förlusten av DNA-metylering i arvsmassan påverkar tillväxt och utveckling. Imprinting hänvisar till differentierade uttryck av moderns och faderns alleler och spelar en viktig roll i reproduktionen utveckling i både däggdjur och växter. DNA-metylering är avgörande för att avgöra om moderns eller faderns alleler av en präglad gen uttrycks eller tystas. I blommande växter, finns det en dubbel befruktning händelse i reproduktion: en spermie befruktar ägget att bilda embryot och en andra säkringar spermier med den centrala cellen för att ge upphov till frövita. Frövitan är vävnaden där imprinting förekommer i växter. Medea, en SET-domän Polycomb grupp gen, och FWA, en transkriptionsfaktor som reglerar blomning, är de första två gener visat sig vara inpräntad i frövita och deras uttryck styrs av DNA-metylering och demetylering i växter. För att avgöra imprinting status för en gen och metylering mönster i frövita, måste vi kunna isolera frövitan först. Eftersom frö är liten i Arabidopsis, är det svårt att isolera Arabidopsis frövita och undersöka dess metylering. I den här videon protokoll, rapporterar vi hur man genomför en genetisk kors, för att isolera frövitan vävnad från frön, och att fastställa den metylering status genom bisulfite sekvensering.

Protocol

I. Genetiska Crossing 1. Emasculating den kvinnliga föräldern För att särskilja moderns och faderns alleler med hjälp av polymorfism DNA-sekvens, två olika ekotyper, t ex Columbia-0 (Col-0) och Ler, kommer att väljas som kvinnliga respektive manliga föräldrar. Plantorna bör vara unga och friska. Man kan försvaga den kvinnliga föräldern med hjälp av en dissekera mikroskop, förstoringsglas visir eller blotta ögat. Leta stadium-12 blommor (Smyth et al…

Discussion

Det är relativt lätt att separera embryo från frövita och utsäde päls, men det är jobbigt att separera frövita från fröskalet, särskilt för utsäde i början eller mitten av torped stadium av fosterutvecklingen. Eftersom fröskalet bara bidrar med en mycket liten mängd vävnad för vissa gener, t ex, MEA och FWA, har vi inte att skilja frövita från frö päls. Det innebär att vi kan isolera RNA från en blandning av frövita och utsäde vävnader päls, kontrollera uttrycket av moderns …

Materials

Supplies

• Dissecting Microscope
• Scissors
• Fine Tip Forceps
• Jewelry Tag
• Plant Stakes
• String or Twist-Ties
• 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
• 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
• Liquid Nitrogen
• Liquid Nitrogen Containers
• Heat Block
• PCR Tubes
• Thermocycler
• Microcentrifuge Tubes
• Microcentrifuge
• Gel Electrophoresis facility
• Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
• Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants

Reagents

• 70% Ethanol
• 95% Ethanol
• 100% Ethanol
• 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
• Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
• 100% Ethanol
• Cholorform
• Restriction Enzymes
• 3 M NaOH
• 6.3 M NaOH
• 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
• Sterile distilled H₂O
• 10 mM Hydroquinone
• Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
• 10 M NH₄OAc
• 20 μg/ μL tRNA
• TE buffer
• The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)