Isolatie en In vitro Activering van Caenorhabditis elegans Sperma
Summary
Een protocol voor het isoleren en het activeren van spermatiden van man<em> C. elegans</em> Wordt hier beschreven. Het snijden van de achterste eind van de mannelijke releases spermatiden. De spermatiden kan worden geactiveerd door toevoeging van protease.
Abstract
Mannen en hermafrodieten zijn de twee van nature seksuele vormen in de nematode C. elegans. De amoeboid zaadcellen worden geproduceerd door zowel mannen en hermafrodieten. In de vroegere fase van gametogenese, de kiemcellen van hermafrodieten differentiëren in een beperkt aantal zaadcellen – ongeveer 300 – en worden opgeslagen in een klein 'zakje' heet de spermatheca. Later, hermafrodieten steeds produceren eicellen 1. In tegenstelling, mannetjes produceren uitsluitend sperma tijdens hun volwassenheid. De mannetjes produceren zoveel sperma dat het goed is voor> 50% van de totale cellen in een typisch volwassen worm 2. Daarom, het isoleren van sperma van mannen is makkelijker dan van die van hermafrodieten.
Slechts een klein deel van de mannen zijn van nature te wijten aan spontane non-disjunctie van X-chromosoom 3 gegenereerd. Kruising hermafrodieten met mannetjes of meer gemakkelijk, de introductie van mutaties aanleiding kunnen geven tot Hem (hoge incidentie van mannetjes) fenotype zijn enkele strategieën waardoor men kan de mannelijke bevolking 3 verrijken.
Mannetjes kunnen gemakkelijk te onderscheiden van hermafrodieten door het observeren van de staart morfologie 4. Hermafrodiet de staart is spits, terwijl mannen staart is afgerond met de paring structuren.
Snijden van de staart releases enorme aantal spermatiden opgeslagen in het mannelijke reproductieve systeem. Dissectie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop met 27 gauge naalden. Omdat spermatiden zijn niet fysiek verbonden met andere cellen, hydraulische verdrijft inwendige inhoud van de mannelijke lichaam, waaronder spermatiden 2.
Mannetjes zijn direct ontleed op een kleine druppel 'Sperma Medium'. Spermatiden zijn gevoelig voor verandering in de pH. Vandaar dat HEPES, een verbinding met een goede buffercapaciteit wordt gebruikt in het sperma media. Glucose en andere zouten aanwezig in het sperma media helpen handhaven osmotische druk om de integriteit van het sperma te behouden.
Post-meiotische differentiatie van spermatiden in de spermatozoa is genoemd spermiogenesis of sperma activering. Shakes 5, 6 en Nelson toonden eerder aan dat ronde spermatiden kan worden opgewekt om in spermatozoa onderscheiden door de toevoeging van verschillende verbindingen, waaronder het activeren van pronase E. Hier laten we zien in vitro spermiogenesis van C. elegans spermatiden gebruik pronase E.
Succesvolle spermiogenesis is randvoorwaarde voor de vruchtbaarheid en daarmee de mutanten defecte in spermiogenesis zijn steriel. Tot nu toe een aantal mutanten is aangetoond dat ze beschadigd zijn specifiek in spermiogenesis proces 7. Afwijkingen gevonden tijdens in vitro activatie van nieuwe Spe (spermatogenese defecte) mutanten ons zou helpen te ontdekken extra spelers die deelnemen aan dit evenement.
Protocol
Discussion
In aanvulling op de analyse van Spe mutanten, dit protocol heeft ook andere belangrijke toepassingen, zoals het analyseren van sperma morfologie bij het ouder worden. Spermatiden en geïsoleerd spermatozoa met dit protocol kan worden gebruikt op andere downstream-experimenten, zoals, immunokleuring van wild-type en mutant sperma 8, 9, beweeglijkheid van sperma op dia's 10, fysiologische metingen 9, 11, of zelfs kunstmatige inseminatie 12.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Samuel Ward, Diane C. Shakes en Gregory Nelson voor baanbrekende deze techniek. Wij danken Pavan Kadandale en Brian Geldziler voor video's tonen geactiveerd spermatozoa, de leden van de Singson lab voor nuttige discussies; CGC voor de stammen en de NIH voor de ondersteuning van ons door subsidie (R01HD054681).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Génétique. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Génétique. 138, 689-692 (1994).
