בתאי גזע pluripotent הגוברת ההשעיה להתמיין גופים embryoid (EBS). כאן אנו מדגימים כיצד להשיג איכות גבוהה EB cryosections שימושי לחקר ההיבטים תאית ומולקולרית של העובר, תוך שמירה על הארגון שלהם כמו אגרגטים.
גזע עובריים (ES) התאים הם תאים שמקורם pluripotent מסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט בשלב עוברי מוקדם יונקים 1. שלב מכריע התמיינות של תאים עובריים היא היווצרות של גופים embryoid (EBS) אגרגטים 2, 3. היווצרות EB מבוסס על צבירת ספונטנית כאשר תאים עובריים הם בתרבית צלחות חסיד לא. תלת ממדי משחזר EB היבטים רבים של יונקים embryogenesis מוקדם להתמיין שלוש שכבות נבט: האאקטודרם והמזודרם ואת האנדודרם 4.
Immunofluorescence וב הכלאה באתרו נמצאים בשימוש נרחב בטכניקות לצורך זיהוי של חלבונים היעד הנוכחי mRNA בתאים של קטע רקמה 5, 6, 7. כאן אנו מציגים טכניקה פשוטה ליצירת cryosections האיכות הגבוהה של הגופים embryoid. גישה זו מסתמכת על האוריינטציה המרחבית של הטבעה EB ב אוקטובר ואחריו הטכניקה cryosection. סעיפים שהתקבל יכולה להיות נתונה למגוון רחב של נהלים אנליטיים על מנת לאפיין אוכלוסיות של תאים המכילים חלבונים מסוימים, RNA או DNA. במובן זה, הכנת EB cryosections (10μm) הם כלים חיוניים לצורך ניתוח מכתים היסטולוגיה (למשל Hematoxilin ו Eosin, DAPI), immunofluorescence (למשל Oct4, nestin) או הכלאה באתרה. טכניקה זו יכולה גם לעזור להבין את ההיבטים של העובר ביחס לשמירה על מבנה תלת מימדי כדורית של EBS.
השיטה המתוארת כאן מספק קל לעקוב אחר פרוטוקול להשיג PFA סעיפים קבועים cryostat דקה של גופים embryoid שימושי immunofluorescence וב מבחני הכלאה באתרה. Cryosections וכתוצאה מכך לאפשר חקר היבטים תאית ומולקולרית של האדם התמיינות בתאי גזע עובריים, תוך שמירה על המבנה שלהם בארגון כמו אגרגט…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי Fundação דה Amparo Pesquisa לעשות Estado לעשות בריו דה ז'נרו (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico דואר Tecnológico (CNPq) ואת Instituto Nacional de Tecnologia Ciência דואר (INCTC). אנו מודים ברונה ס פאולסן ואלין מ פרננדס לתמונות EB.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |