胚様体の凍結切片を使用して、多能性幹細胞の解析
Summary
懸濁液中で成長して多能性幹細胞は胚様体（EB）に分化する。集合体としての組織を維持しながら、ここでは、胚発生の細胞および分子的側面を研究するための有用な高品質のEBの凍結切片を取得する方法を示します。
Abstract
胚性幹（ES）細胞は胚盤胞段階の初期の哺乳類の胚1の内部細胞塊に由来する多能性細胞である。 ES細胞の分化に重要な段階は、胚様体（EB）を集約2,3の形成である。 ES細胞は非接着プレートで培養されているときにEBの形成が自発的凝集に基づいています。外胚葉、中胚葉と内胚葉4：三次元EBの反復するには、多くの初期の哺乳類の胚発生の側面とは、三胚葉に分化する。
免疫蛍光法およびin situハイブリダイゼーションは、広く組織部5、6、7の細胞に存在する標的蛋白質とmRNAの検出のための技術を使用している。ここでは、胚様体の高品質の凍結切片を生成する単純な手法を提示する。このアプローチは、凍結切片法に続いて、OCTで埋め込むEBの空間的な向きに依存しています。結果のセクションは、特定のタンパク質、RNAまたはDNAを含む細胞集団を特徴づけるために、分析的手続の多種多様に供することができる。この意味で、EB凍結切片の準備（10μm以下）は組織学的染色の解析に必須のツール（例えば、ヘマトキシリンとエオシン、DAPI）、免疫蛍光（例えばOct4の、ネスチン）またはin situハイブリダイゼーションである。また、この手法は、EBの三次元球状構造の維持にに関してと胚の側面を理解するのに役立ちます。
Protocol
Discussion
方法は、免疫蛍光およびin situハイブリダイゼーションアッセイに有用な胚様体のPFA固定薄凍結切片を得るためにわかりやすいプロトコルを提供するここで説明する。集合体としての構造や組織を維持しながら、結果として凍結切片は、ヒト胚性幹細胞の分化の細胞および分子的側面の研究を可能にする。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はFundaçãoパコデアンパロによってサポートされていたPesquisaエスタードが行う作業リオデジャネイロ（FAPERJ）、ConselhoナシオナルデDesenvolvimento Científico電子モンテ（CNPq）とセルバンテスナシオナルデCiênciaのe Tecnologia（INCTC）。我々は、ブルーナS.ポールセンやEBの画像のアラインM.フェルナンデスに感謝しています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
References
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